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Ricerca sul cancro
0 visualizzazioni • 5:22 min • April 30th, 2023
Un tumore contiene una piccola frazione di cellule staminali note come popolazione laterale. Queste cellule sono chemioresistenti, il che le rende responsabili della recidiva del cancro.
Per isolare la popolazione laterale di cellule tumorali, iniziare aggiungendo Hoechst - una soluzione colorante fluorescente - alla fiala contenente la sospensione di cellule tumorali. All'interno delle normali cellule tumorali, le molecole di Hoechst entrano nel nucleo e si legano alla regione ricca di A-T nel DNA, portando a un'elevata fluorescenza in queste cellule.
Al contrario, la popolazione laterale contiene un'alta concentrazione di trasportatori ABC - pompe di efflusso che rimuovono rapidamente le molecole di colorante dalla cellula. Questo efflusso attivo di molecole di colorante fa sì che la popolazione laterale sia fluorescente a bassa intensità.
Ora, prendi un'altra fiala di cellule tumorali trattate con Hoechst e aggiungi Verapamil. Questa fiala funge da controllo poiché Verapamil blocca i trasportatori ABC. Questo passaggio provoca una riduzione dell'efflusso di Hoechst e trattiene il colorante all'interno delle celle laterali della popolazione.
Successivamente, controcolorare le cellule in entrambe le fiale utilizzando ioduro di propidio. Lo ioduro di propidio entra esclusivamente nel nucleo delle cellule morte e si intercala tra le basi del DNA. Questo porta ad un'elevata fluorescenza nelle cellule morte.
Infine, ordina le cellule utilizzando un selezionatore cellulare attivato dalla fluorescenza o FACS. Il FACS separa le cellule tumorali e le cellule morte altamente fluorescenti che trattengono Hoechst dalle cellule della popolazione laterale a bassa fluorescenza.
Per selezionare una popolazione laterale di cellule staminali tumorali mediante saggio di efflusso colorante di Hoechst, etichettare prima una provetta conica "Hoechst" e una "Hoechst e Verapamil". Successivamente, lavare una coltura cellulare HNSCC con PBS sterile, seguito dall'aggiunta di 1 millilitro di tripsina-EDTA. Dopo 3 minuti a 37 gradi Celsius, interrompere la reazione con un terreno di coltura cellulare fresco e contare le cellule. Diluire la coltura a 1 volta da 10 a settima cellula per millilitro in terreno completo della linea cellulare parentale.
Quindi, aggiungere 100 microlitri alla provetta "Hoechst e Verapamil" e 4 millilitri di cellule alla provetta "Hoechst". Successivamente, mescolare delicatamente 10 microlitri di soluzione di Verapamil cloridrato da 5 millimolari nel campione "Hoechst e Verapamil", seguiti da 5 microlitri di Hoechst per 1 volte 10 alla sesta cellula di entrambe le provette. Quindi, coprire i campioni con un foglio di alluminio e posizionarli a 37 gradi Celsius. Dopo 90 minuti con miscelazione delicata ogni 15 minuti, centrifugare le provette e risospendere i pellet in 2 millilitri di PBS.
Dopo una seconda centrifugazione, risospendere il pellet "Hoechst e Verapamil" in 500 microlitri di ioduro di propidio in PBS e il pellet "Hoechst" in 4 millilitri dello stesso. A questo punto, filtrare i campioni attraverso filtri cellulari da 70 micron in provette FACS per rimuovere eventuali aggregati e posizionare i campioni su ghiaccio al riparo dalla luce. Quindi, caricare il campione "Hoechst" sul citometro a flusso e aprire la finestra "Global Worksheet" nel software del citometro a flusso. Fare clic su "Dot Plot" per creare un grafico sul foglio di lavoro globale e fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare i parametri di dispersione in avanti e lateralmente.
Crea un grafico a punti a dispersione laterale larga per un'altezza di dispersione laterale allo stesso modo, quindi fai clic su "Polygon Gate" per creare una regione P1 nel secondo grafico per selezionare le singole celle e discriminare i doppietti. Quindi, crea un'area di Hoechst rossa con un grafico a punti dell'area di Hoechst blu e fai clic con il pulsante destro del mouse sulle celle per evidenziare la popolazione P1. Quindi, creare una regione P2 per selezionare la popolazione negativa di cellule del colorante Hoechst che appare come un'arma laterale a sinistra della popolazione principale di cellule e raccogliere 10.000 degli eventi campione "Hoechst".
Per verificare che il gate P2 che rappresenta la popolazione laterale sia posizionato correttamente, raccogli anche 10.000 eventi campione "Hoechst e Verapamil". La popolazione laterale dovrebbe scomparire. Quindi, smistare la popolazione laterale di cellule negative al colorante di Hoechst in un tubo conico da 15 millilitri contenente 1 millilitro di terreno cellulare completo simile a una staminali tumorale. Alla fine dell'ordinamento, far girare le cellule e risospendere il pellet di popolazione laterale in 1 millilitro di terreno cellulare fresco completo simile a una staminale. Quindi, contare le cellule e seminarle al numero appropriato in un nuovo pallone di coltura cellulare.