A High-throughput piattaforma automatica per lo sviluppo di linee cellulari di produzione per Therapeutics Proteine

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sviluppare linee cellulari di produzione per farmaci biologici con clonalità e alta produttività. Ciò si ottiene effettuando prima il transetto, la cellula ospite con il DNA, codificando il gene di interesse. Il passo successivo della procedura consiste nell'isolare i cloni ad alta produzione in base ai fatti, seguiti dalla documentazione della formazione delle colonie da parte dell'imager di selezione dei cloni.

Il passaggio finale consiste nello screening e nella selezione di cloni altamente produttivi. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la produzione di anticorpi in colture batch continue e alimentate attraverso l'HPLC in fase inversa. Video. La dimostrazione di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi di smistamento e pcan 80 dgl sono difficili da apprendere perché in queste procedure è coinvolta una configurazione complessa, i seguenti scienziati di un laboratorio dimostreranno queste procedure per la trasfezione dell'effetto della cellula ospite, smistamento di Jason Sanders per la documentazione della formazione delle colonie e Russell Kan per il campionamento del tecan.

Ed Eliza Per iniziare questa procedura un giorno prima della trasfezione, seminare le cellule ospiti in una fiaschetta di coltura cellulare in 15 millilitri di crescita. Medio. Incubare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius, 7,5% di anidride carbonica il giorno successivo, preparare i complessi di trasfezione, diluire prima otto microgrammi, il DNA in 800 microlitri di terreno di crescita senza siero in una provetta sterile per microcentrifuga mescolata delicatamente. Successivamente, diluire 40 microlitri di labbra in 800 microlitri di terreno di crescita senza siero in un tubo di polistirene.

Aggiungere il DNA diluito alla lipofectamina diluita. Mescolare delicatamente e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per preparare le cellule ospiti alla trasfezione. Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule e sostituirlo con 6,4 millilitri di terreno di coltura senza siero.

Aggiungere 1,6 millilitri di complessi di trasfezione al pallone. Mescolare delicatamente facendo oscillare il pallone. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica per sei ore.

Dopo sei ore, aggiungere otto millilitri di terreno di coltura al pallone e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica durante la notte del giorno successivo. Rimuovere il terreno per aspirazione e aggiungere al pallone un terreno di crescita fresco. Incubare nuovamente le cellule durante la notte dopo l'incubazione notturna.

Sostituisci il terreno di coltura con la selezione. Medio. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica per due o tre settimane. Due o tre settimane dopo essere state trasfettate, le cellule sono pronte per la clonazione mediante citometria a flusso, selezione cellulare attivata, cellule rimosse dal pallone e centrifugazione a 800 giri/min per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Risospendere le cellule nel terreno di selezione, integrato con il 2% di albumina sierica bovina. Quindi aggiungere l'anticorpo IgG anti-umano marcato in fluorescenza. Aggiungere una diluizione da uno a 20, incubare con ghiaccio per 15-30 minuti, quindi lavare due volte con cellule di risospensione PBS fredde in un XPBS in una provetta di polipropilene.

Un esempio di cellule colorate è mostrato in questa immagine per lo smistamento asettico su un fax BD aria preparare una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti che contiene 200 microlitri di terreno di selezione in ciascun pozzetto. Caricare asetticamente la provetta con le cellule e analizzare i fatti BD. Aria, registra i risultati rispettivamente per le cellule colorate e non colorate.

Impostare i cancelli e le impostazioni per ordinare le singole cellule del profilo di colorazione fluorescente desiderato nella piastra a 96 pozzetti Incubare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per due settimane al giorno zero, al giorno tre, al settimo giorno e al giorno 13 dopo lo smistamento dei fatti documentare la formazione di colonie nella piastra a 96 pozzetti su un clone Selezionatore imager per garantire la selezione dei cloni derivati da una singola cellula da esaminare e selezionare per un'elevata produttività cloni. Posizione del campione del primo documento nella piastra di saggio a 96 pozzetti ricevente. Quindi utilizzare un sistema robotico di manipolazione dei liquidi per trasferire aliquote di 20 microlitri di surnatante in ciascun pozzetto della piastra di dosaggio a 96 pozzetti, la produzione di anticorpi nei campioni viene analizzata da un sandwich.

Le IgG umane rilevano ELI SA sul sistema di manipolazione dei liquidi nel modo seguente. In primo luogo, i campioni e uno standard vengono caricati su piastre precodificate per il saggio delle IgG anti-umane con bio cappotto. Le piastre vengono incubate a temperatura ambiente per due ore, seguite da tre lavaggi PBS.

Prossimo immuno puro capra anti-umano IgG. L'HRP viene aggiunto alle piastre a una diluizione da una a 2000 e le piastre vengono incubate per un'ora a temperatura ambiente. Dopo un'ora, le lastre vengono lavate tre volte con PBS e quindi viene aggiunto il substrato A BTS.

Infine, le piastre sono rosse su un lettore di piastre utilizzando l'assorbanza a 405 nanometri per il rilevamento. Utilizzando questa piattaforma automatizzata, è stato scoperto che il livello di anticorpi superficiali riflesso dalla colorazione con IgG anti-umane marcate con fluorescenza è correlato alla produttività anticorpale della cellula. Come mostrato qui per i primi due cloni generati dalla popolazione cellulare con un'elevata espressione di anticorpi di superficie, la produttività specifica variava da 50 a 70 picogrammi per cellula al giorno.

Al contrario, la produttività degli anticorpi era di circa 20 picogrammi per cellula al giorno per i primi due cloni generati dalla popolazione cellulare con bassa espressione di anticorpi di superficie. Inoltre, le linee cellulari sviluppate mediante fact sorting sono più stabili rispetto alla produzione di anticorpi rispetto a quelle clonate attraverso la diluizione manuale limitante. La produttività specifica del clone clone superiore generato dalla diluizione manuale limitante è scesa da circa 30 PCD a circa 10 PCD dopo la coltura per 80 raddoppi cellulari.

D'altra parte, il sottoclone superiore generato dal clone di smistamento fax due è stato in grado di mantenere la produttività specifica intorno a 20 PCD per almeno 100 raddoppi di cellule. L'identificazione del sito di integrazione del transgene nel cromosoma cellulare mediante ibridazione fluorescente in situ ha dimostrato che il clone uno è una popolazione mista di fenotipo A e fenotipo B.In contrasto, il fatto che il clone selezionato sembrava essere una popolazione più omogenea con il 99,5% delle cellule del fenotipo A.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare linee cellulari di produzione per la protezione delle proteine terapeutiche.