Name: A High-throughput piattaforma automatica per lo sviluppo di linee cellulari di produzione per Therapeutics Proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Scopri lo sviluppo di linee cellulari ad alta produttività per proteine terapeutiche utilizzando citometria a flusso e imaging automatizzato. Questo metodo migliora la stabilità e la riproducibilità nella produzione di biologici.

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1. Della cellula ospite trasfezione <ol><li> Semi di 2 x 10 6 CHO-DXB11 cellule in coltura cellulare T75 fiasco Corning in 15 ml di mezzo di crescita (MEMA con nucleotidi e nucleosidi (Gibco, numero di catalogo 12571) integrata con 10% di γ-irradiati caratterizzato siero fetale bovino (cFBS) (Hyclone, numero di catalogo SH30071.03) e 10 mL / L di una soluzione di glucosio al 45% (Sigma, numero di catalogo G8769)) un giorno prima della trasfezione. </li><li> Al momento della transfezione, preparare complessi trasfezione come segue: <ol class="lalpha"><li> Diluire il DNA 8 mg in 800 ml di terreno di coltura senza siero in una provetta sterile. Mescolare delicatamente. </li><li> Diluire 40 microlitri Lipofectamine ™ (Invitrogen 18.324.012) in 800 ml di terreno di coltura senza siero in una provetta di polistirolo. </li><li> Aggiungere il DNA diluito al ™ Lipofectamine diluito. Mescolare delicatamente e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Rimuovere il terreno di crescita da parte delle cellule T75 e sostituire con 6,4 ml di terreno di coltura senza siero. Aggiungere il 1,6 ml di complessi trasfezione al pallone. Mescolare delicatamente la piastra a dondolo. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 per 6 ore. </li><li> Aggiungere 8 ml di terreno di crescita per il pallone e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 durante la notte. </li><li> Rimuovere media tramite aspirazione e aggiungere mezzo fresco di crescita al pallone. Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 durante la notte. </li><li> Sostituire il terreno di crescita di medio selezione (media MEMA senza nucleotidi o nucleosidi (Gibco, numero di catalogo 12561) integrata con 10% di γ-irradiati dializzati siero fetale bovino (DFB) (Hyclone, numero di catalogo SH30079.03) e 10 mL / L 45 % soluzione di glucosio (Sigma, numero di catalogo G8769)). </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 per 2-3 settimane. </li></ol> 2. Clonazione ordinando Citometria a cella di flusso attivo <ol><li> Staccare le cellule dal pallone e centrifugare a 800 rpm per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere le cellule in terreno selezione integrato con il 2% di albumina sierica bovina e fluorescente anti-IgG umane a 1:20 diluizione. </li><li> Incubare in ghiaccio per 15-30 minuti e poi lavare due volte con PBS freddo. Risospendere le cellule in PBS 1x in un tubo di polipropilene. </li><li> Preparati per una sorta asettico FACSAria BD ™. Preparare 96-pozzetti di coltura cellulare che contiene 200 microlitri medio di selezione in ciascun pozzetto. </li><li> Asetticamente caricare il tubo con le cellule e analizzare su BD FACSAria ™, registrare i risultati di cellule colorate e senza macchia, rispettivamente. </li><li> Impostare le porte e le impostazioni per ordinare singole cellule del profilo di fluorescenza desiderato colorazione in piastra a 96 pozzetti (s). <ol class="lalpha"><li> Cellule transfettate vengono prima analizzati sulla base di dispersione in avanti rispetto a dispersione laterale. Un cancello di cellule vive è fatto sulla base di dispersione in avanti, che misura la dimensione di una cellula, e side scatter, che misura la complessità di una cellula o di granularità. </li><li> Le cellule che rientrano in questa porta vengono poi esaminati per la colorazione PE. Cancello PE negativo è impostato per macchia o cellule transfettate cellule ospiti macchiato. Come macchiato cellule transfettate vengono esaminati da FACS, la "High PE" cancello è poi delineato per comprendere i primi 5% di tutte le cellule che sono positivi per la colorazione PE. </li></ol></li><li> Incubare le piastre in incubatore a 37 ° C per due settimane. </li></ol> 3. Documentazione di formazione di colonie di CloneSelect ™ Imager Documento formazione di colonie in piastre da 96 pozzetti su CloneSelect Imager ™ al giorno 0, giorno 3, giorno 7 e il giorno 13 dopo FACS ordinamento. La documentazione immagine garantirà selezione dei cloni derivati ​​da una singola cellula. Un passo fondamentale in questa documentazione è sempre il piano focale regolata correttamente per la misurazione giorno 0, dato che c'è una sola cellula di ogni bene in quel punto. E 'molto importante che le immagini di queste celle singole sono a fuoco e cercare di regolare il fuoco su di essi possono essere fuorvianti al meglio. Il piano focale può variare notevolmente tra le marche di piatti e forse anche da lotto a lotto della stessa marca. Quindi un pre-determinato piano focale deve essere utilizzato. Questo può essere realizzato puntando sulla prova di micro-perle o cellule ad alta densità depositato su lastre dello stesso lotto in uso. In alternativa, le piastre completamente cresciuto da una stessa partita possono essere utilizzati per questo scopo. FACS dopo l'ordinamento, è anche importante per permettere alle cellule accontentarsi di un minimo di 2 ore prima di imaging, in modo che possano essere 'fisso' in posizione sul piatto. 4. Lo screening e la selezione di cloni altamente produttiva <ol><li> Documento di posizione del campione nel ricevere piastre a 96 pozzetti test. </li><li> Aliquote trasferimento di 20 microlitri surnatante (diluire se necessario) in piastre da 96 pozzetti saggio dal TECAN Freedom EVO ® sistema di gestione dei liquidi. Questo robot flessibili e capacipiattaforma ic è stato adattato per questo e altri servizi telefonici automatizzati lavoro colture cellulari. Programmi speciali sono stati scritti per utilizzare al meglio e migliorare le capacità EVO Libertà robotica per lo sviluppo di linee cellulari. Un esempio di questo è l'impostazione del TECAN di interpretare CloneSelect ™ dati Imager per il campionamento pozzetti con singole colonie. Altri programmi sono stati tenuti a eseguire ulteriori operazioni di coltura cellulare tali da rendere le diluizioni appropriata dei campioni prelevati, interpretare, catalogare e piastre di esempio manualmente segnato, se necessario, di scalare in alto la produzione di cloni, ecc Molti di questi programmi possono essere facilmente applicata a 384 pozzetti così come l'originale formato 96 bene. </li><li> Produzione di anticorpi nei campioni viene analizzato da un sandwich di IgG umano rilevazione ELISA (Pierce, Rockford, IL) sulla libertà TECAN EVO ® sistema di gestione dei liquidi. <ol><li> Campioni e standard (umani mieloma IgG1 kappa) (Sigma, St. Louis, MO) sono stati caricati su preverniciato Bio Coat Anti-Human Piastre Assay IgG (BD Biosciences, San Jose, CA). </li><li> Le piastre sono state incubate a temperatura ambiente per due ore, seguita da tre lavaggi PBS. </li><li> ImmunoPure capra anti-IgG (Fc-gamma)-HRP (Pierce, Rockford, IL) è stato aggiunto alla piastra a una diluizione 1:2000 e incubate per un'ora a temperatura ambiente. </li><li> Le piastre sono state lavate tre volte con PBS prima dell'aggiunta del substrato ABTS (Pierce, Rockford, IL) e sono stati letti su un lettore di piastre con assorbanza a 405 nm per il rilevamento. </li></ol></li><li> Selezionare cloni altamente produttivi e di valutare la produttività nella cultura sospensione. Per fed-batch cultura, le cellule sono state inoculate in 0.3X106 cellule / ml in vantaggio medio libero proteina JRH IMMEDIATA 65578 (RdC Biosciences, Lenexa, KS) integrata con 5 g / L di soia idrolizzato (DMV International, numero di catalogo SE50MAF-UF, lotto numero) e incubate a 37 ° C con 7,5% di CO 2. La cultura continuato e sono stati integrati con 2 g / L di glucosio (Sigma, numero di catalogo G8769, numero di lotto 098K2329) quando il glucosio, più concentrazione di lattato nella cultura raggiunto sotto di 2 g / L, e nutriti 2 mM glutammina (Gibco, numero di catalogo 25030, numero di lotto 568177) quando i livelli di glutammina raggiunto sotto i 200 mg / L (metaboliti misurati con YSI Bioanalyzer). Fed-batch culture si conclusero il giorno 14 e la produzione di anticorpi è stata misurata mediante HPLC in fase inversa. </li><li> Caratterizzazione genetica di cloni candidato da parte ibridazione in situ fluorescente (FISH) 5. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Un esempio di sviluppo di produrre anticorpi cloni con il metodo di throughput elevato è mostrata in Figura 1 e Figura 2. Pool di cellule transfettate era macchiata di fluorescente anti-IgG umane (Figura 1A), analizzati e ordinati su BD FACSAria ™ (Figura 1B). Formazione di colonie in piastra da 96 pozzetti è stato ripreso in CloneSelect Imager ™ (Figura 1C). Supernatante di coltura cellulare è stata prelevata da pozzi che contengono singola colonia e dosati mediante test ELISA sul sistema TECAN Freedom EVO ® movimentazione liquidi (Figura 1D). Cloni altamente produttivi sono stati trovati dalle cellule che mostravano più alto livello di anticorpi di superficie riflessa con la colorazione fluorescente anticorpi anti-IgG umane. Quando si confrontano cloni generati da due popolazioni della piscina iniziale delle cellule transfettate, una grande differenza in termini di produttività in fed-batch è stata osservata la cultura (Figura 2). Per i primi due cloni generati dalla popolazione di cellule con elevata espressione di anticorpi di superficie (PE alto), la produttività specifica variava dal 50-70 pg / cellula / giorno. Mentre la produttività degli anticorpi è stata circa 20 pg / cellula / die per i primi due cloni generati dalla popolazione di cellule con bassa espressione di anticorpi di superficie (PE basso). Inoltre, le linee cellulari sviluppato da ordinamento FACS sono più stabili rispetto alla produzione di anticorpi rispetto a quelli che sono stati clonati per diluizione calcinazione manuale (Figura 3A). La produttività specifica del clone in alto, "Clone 1", generato dalla diluizione calcinazione manuale è sceso da circa 30 pcd a ~ 10 pcd dopo coltura per 80 raddoppi cellulare. D'altra parte, la parte superiore sottoclone generato da FACS ordinamento, "Clone 2", è stato in grado di mantenere la produttività specifica circa 20 pcd per almeno 100 raddoppi cellulare. Da ibridazione in situ fluorescente (FISH), abbiamo dimostrato Clone 1 ha mostrato come una popolazione mista di fenotipo A (85%) e fenotipo B (15%). Al contrario, FACS ordinati clone (clone 2) ha dimostrato di essere una popolazione più omogenea, con il 99,5% delle cellule si è rivelato un fenotipo (Figura 3B). <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Sviluppo di linee di produzione di celle per la produzione di anticorpi monoclonali di cellule CHO. A) colorazione superficiale della piscina iniziale delle cellule transfettate con fluorescente anti-IgG umane. B) Ordinamento della popolazione di cellule con elevata intensità di fluorescenza (PE alto) e bassa intensità di fluorescenza (PE bassa) in piastra da 96 pozzetti. C) Documentazione coloniaformazione dal giorno 0 al giorno 13 semina messaggi il CloneSelect Imager ™. D) cloni di screening mediante ELISA. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Livello di anticorpi di superficie associata è correlata con la produttività degli anticorpi della cellula. Cloni con alta e bassa colorazione fluorescente sono stati entrambi sviluppati in linee cellulari e valutati in fed-batch cultura. Volumetrico titolo e produttività specifica sono stati confrontati tra top 2 cloni di ogni popolazione. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Cloni generati da FACS ordinamento mostrano maggiore omogeneità genetica e stabilità clone. A) la produzione di anticorpi stabilità nella cultura batch per ~ 80 raddoppiamenti cellulari cultura trascorrere del tempo. Δ, clone è stata generata tramite diluizione limite, dove le cellule sono state seminate a 2000 cellule / pozzetto, 1000 cellule / pozzetto e 500 cellule / pozzetto. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010triangle.jpg" alt="Triangolo Nero" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Triangolo nero"> , Clone è stata generata tramite FACS a 1 cella / bene. B) l'integrazione del sito Transgene nel cromosoma cellulare CHO è identificata da ibridazione in situ fluorescente.

<ol><li>Hung, F., Deng, L., Ravnikar, P., Condon, R., Li, B., Do, L., Saha, D., Tsao, Y. S., Merchant, A., Liu, Z., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+stability+and+antibody+production+in+CHO+cells%3A+improvement+through+gene+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">mRNA stability and antibody production in CHO cells: improvement through gene optimization.</a> Biotechnol. J. 5, 393-401 (2010).</li>
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Gli autori di questo articolo sono dipendenti della Merck &amp; Co., Inc., che utilizzano questo metodo per la produzione su larga scala di proteine ​​terapeutiche da linee cellulari di mammiferi.

Abbiamo presentato un sistema automatizzato cella di produzione piattaforma di linea di sviluppo che consente l&#39;isolamento di cloni altamente produttivi, e nel mezzo, mentre assicura clonalità e stabilità clone. L&#39;impegno della colorazione superficiale anticorpi seguita da ordinamento FACSAria cellula ™ è la chiave per ottenere cloni singola con anticorpi ad alta produttività. I nostri risultati e le relazioni di altri 2-4 suggeriscono che il livello di anticorpi transitoriamente visualizzata sulla superficie cellulare una buona correlazione con la produttività della cellula. Così, un fluoresceina coniugato anticorpo può essere utilizzato per riconoscere il prodotto membrana associati e aiuti l&#39;isolamento dei produttori alto. In alternativa, coespressione di geni reporter e MicroDrop tecnologia gel sono stati utilizzati per facilitare la selezione di alta produzione di cloni di FACS 6-8. Oltre ad isolare cloni alta produzione tramite FACS, altre tecnologie si sono evolute per raggiungere lo stesso obiettivo. Queste includono la tecnologia CellSpot Bioscience a traliccio che utilizza microspere sistemi di rilevamento degli anticorpi e lo screening della tecnologia laser per identificare cloni altamente produttivo ed eliminare le cellule indesiderate, Genetix ClonePix FL e StemCell Tecnologie ClonaCell piattaforma EasyPick che eseguono lo screening ad alta velocità di linee cellulari di produzione mediante un sistema di rilevamento degli anticorpi fluorescenti . Abbiamo scelto di implementare il metodo FACS clonazione in base al livello di anticorpi superficiali associate perché combina la facilità di funzionamento, la selettività sulla produttività e sulla clonalità. L&#39;impiego del sistema di gestione TECAN Freedom EVO ® liquido aumentato significativamente il throughput screening, che offrono la possibilità di selezionare per i cloni ad alto rendimento da un pool di cellule molto più grande. Altra strumentazione per test, come HTRF, Bioforte Ottetto, HPLC, ecc, sono tutti i mezzi possibili di selezione dei produttori di alta e bassa screening dei produttori. Tenendo traccia formazione clone con CloneSelect Imager ™, abbiamo generato la documentazione necessaria per dimostrare clonalità con la storia digitalizzati linea cellulare. Clonalità è ulteriormente confermata da caratterizzare geneticamente singolo sito di integrazione del transgene nel cromosoma. Un passo subcloning, che di solito adottati per garantire clonalità, possono quindi essere eliminati. Questo farà risparmiare 4-8 settimane di tempo per lo sviluppo di linee cellulari. In sintesi, le linee cellulari di qualità generato dalla high-throughput piattaforma automatizzata ha dimostrato l&#39;alta produttività, stabilità di produzione e documentata storia linea cellulare che dovrebbe soddisfare la domanda per la produzione su larga scala e attuali requisiti normativi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td></tr><tr><td> BD FACS Aria ™ cell sorter </td><td> BD Bioscience </td></tr><tr><td> CloneSelect ™ Imager </td><td> Genetix </td></tr><tr><td> TECAN Freedom EVO ® sistema di gestione dei liquidi </td><td> Tecan Group </td></tr></tbody></table>

a high-throughput piattaforma automatica per lo sviluppo di linee cellulari di produzione per therapeutics proteine

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

La rapida crescita dell&#39;industria biofarmaceutica esigenze rapido sviluppo di sistemi di produzione altamente efficiente e affidabile per soddisfare i requisiti crescenti per le forniture di droga. La generazione di linee cellulari di produzione ha sempre coinvolto le operazioni manuali che sono alta intensità di manodopera, bassa produttività e vulnerabili a errori umani. Riportiamo qui una piattaforma integrata high-throughput e automatizzato per lo sviluppo di linee di produzione di celle per la produzione di proteine ​​terapeutiche. La combinazione di BD FACS Aria ™ cell sorter, CloneSelect ™ Imager e TECAN Freedom EVO ® sistema di gestione dei liquidi ha permesso un alto throughput e più efficiente linea processo di sviluppo delle cellule. In questa operazione, cellule ospiti produzione sono prima transfettate con un vettore di espressione che trasportano il gene di interesse 1, seguito dal trattamento con un agente di selezione. Il stabilmente transfettate cellule vengono poi colorate con fluorescenza anticorpi anti-IgG umane, e successivamente sottoposti ad analisi in citometria a flusso 2-4. Cellule altamente produttive sono selezionati sulla base di intensità di fluorescenza e sono isolate da singole cellule ordinamento su un FACSAria BD ™. Formazione di colonie da singole cellule stadio è stato rilevato al microscopio e una serie di giri nel tempo le immagini digitali vengono prese CloneSelect ™ Imager per la documentazione della storia della linea cellulare. Dopo singoli cloni si sono formati, questi cloni sono stati sottoposti a screening per la produttività mediante test ELISA eseguito su un TECAN Freedom EVO ® sistema di gestione dei liquidi. Circa 2.000 - 10.000 cloni possono essere sottoposti a screening per ciclo di funzionamento con la configurazione del sistema attuale. Questo approccio integrato è stato usato per generare alta produzione ovarica di criceto cinese (CHO) linee cellulari per la produzione di anticorpi terapeutici monoclonali (mAb) così come le loro proteine ​​di fusione. Con l&#39;aiuto di diversi tipi di sonde di rilevazione, il metodo può essere utilizzato per lo sviluppo di terapie proteiche o essere applicata ad altri sistemi host di produzione. Confrontando la procedura manuale tradizionale, questa piattaforma automatizzata dimostrato vantaggi di significativo aumento di capacità, garantita clonalità, la tracciabilità nella storia linea cellulare con documentazione elettronica e di opportunità molto ridotta per errore dell&#39;operatore.

Un elevato throughput, piattaforma automatizzata di sviluppo delle cellule linea di produzione per la produzione di proteine ​​terapeutiche è descritto. Implementazione di Cell BD FACS sorter Aria, CloneSelect Imager e TECAN Libertà sistema di movimentazione EVO liquido ha dimostrato capacità di elaborazione significativamente aumentata in linea con lo sviluppo delle cellule migliore qualità linea cellulare e alta riproducibilità.

A High-throughput piattaforma automatica per lo sviluppo di linee cellulari di produzione per Therapeutics Proteine

L'industria biofarmaceutica, in rapida crescita, richiede lo sviluppo accelerato di sistemi di produzione altamente efficienti e affidabili per soddisfare l'aumentare di...

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare linee cellulari produttive per biologici con clonalità e alta produttività. Questo viene raggiunto innanzitutto trasfettando la cellula ospite con DNA che codifica il gene di interesse. Il passaggio successivo della procedura consiste nell'isolare i cloni ad alta produzione mediante FACS, seguito dalla documentazione della formazione di colonie effettuata dal clone select imager.L'ultimo passaggio consiste nel selezionare e isolare i cloni altamente produttivi. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la produzione di anticorpi in colture continue e in batch con alimentazione, mediante HPLC in fase inversa. Il video. La dimostrazione di questo metodo è fondamentale poiché le fasi di sorting e pcan 80 dgl sono difficili da apprendere a causa della complessità dell'allestimento richiesto; i seguenti scienziati di un laboratorio illustreranno queste procedure per la trasfezione dell'effetto sulla cellula ospite, lo sorting a cura di Jason Sanders per la documentazione della formazione delle colonie e il campionamento effettuato da Russell Kan per TECAN.E Eliza Per iniziare questa procedura, il giorno precedente la trasfezione, seminare le cellule ospiti in un fiasco da coltura cellulare con 15 millilitri di mezzo di crescita. Incubare le cellule in un'incubatrice a 37 gradi Celsius, con 7,5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, preparare innanzitutto i complessi di trasfezione: diluire otto microgrammi di DNA in 800 microlitri di mezzo di crescita senza siero in un tubo sterile per microcentrifuga, mescolando delicatamente. Successivamente, diluire 40 microlitri di lip in 800 microlitri di mezzo di crescita senza siero in un tubo di polistirene.Aggiungere il DNA diluito al Lipofectamine diluito. Mescolare delicatamente e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per preparare le cellule ospiti alla trasfezione. Rimuovere il mezzo di crescita dalle cellule e sostituirlo con 6,4 millilitri di mezzo di crescita senza siero.Aggiungere 1,6 millilitri dei complessi di trasfezione al fiasco. Mescolare delicatamente oscillando il fiasco. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore con anidride carbonica per sei ore.Dopo sei ore, aggiungere otto millilitri di mezzo di crescita al matraccio e incubare a 37 gradi Celsius in un'incubatrice a biossido di carbonio durante la notte al giorno successivo. Rimuovere il mezzo per aspirazione e aggiungere mezzo di crescita fresco al matraccio. Incubare nuovamente le cellule durante la notte dopo l'incubazione notturna.Sostituire il terreno di coltura con il terreno di selezione. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore a biossido di carbonio per due o tre settimane. Due o tre settimane dopo la trasfezione, le cellule sono pronte per essere clonate mediante citometria a flusso; staccare le cellule dalla fiasca e centrifugare a 800 giri/min per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Risospendere le cellule nel mezzo di selezione, integrato con il 2% di albumina sierica bovina. Quindi aggiungere l'anticorpo anti-IgG umana marcato con fluorocromo. Aggiungere una diluizione da uno a 20, incubare sul ghiaccio per 15-30 minuti, quindi lavare due volte con PBS freddo e risospendere le cellule in un volume di PBS in un tubo di polipropilene.Un esempio di cellule colorate è mostrato in questa immagine per un'ordinazione asettica su un BD FACS Aria. Preparare una piastra per colture cellulari a 96 pozzetti contenente 200 microlitri di mezzo di selezione in ogni pozzetto. Caricare asetticamente il tubo con le cellule e analizzare sul BD FACS Aria, registrando i risultati rispettivamente per cellule colorate e non colorate.Impostare le porte e le impostazioni per ordinare singole cellule con il profilo di colorazione fluorescente desiderato nella piastra a 96 pozzetti; incubare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per due settimane. Ai giorni zero, tre, sette e tredici dopo l'ordinamento cellulare, documentare la formazione di colonie nella piastra a 96 pozzetti mediante un clone select imager, per garantire la selezione di cloni derivati da una singola cellula, al fine di selezionare cloni altamente produttivi. Prima di tutto, registrare la posizione del campione nella piastra saggio ricevente a 96 pozzetti. Successivamente, utilizzare un sistema robotizzato di gestione dei liquidi per trasferire aliquote di 20 microlitri di sopranatante in ciascun pozzetto della piastra saggio a 96 pozzetti. La produzione di anticorpi nei campioni viene analizzata mediante un saggio sandwich.ELISA per il rilevamento di IgG umana sul sistema di gestione dei liquidi nel modo seguente. Innanzitutto, i campioni e uno standard vengono caricati su piastre per saggio pre-codificate con rivestimento biologico anti-IgG umana. Le piastre vengono incubate a temperatura ambiente per due ore, seguite da tre lavaggi con PBS.Successivamente, viene aggiunto alle piastre l'anticorpo secondario caprino anti-IgG umana purificato coniugato con HRP, diluito 1:2000, e le piastre vengono incubate per un'ora a temperatura ambiente. Trascorsa un'ora, le piastre vengono lavate tre volte con PBS e quindi viene aggiunto il substrato A BTS.Infine, le piastre vengono lette su un lettore di piastre utilizzando l'assorbanza a 405 nanometri per la rilevazione. Utilizzando questa piattaforma automatizzata, si è scoperto che il livello di anticorpi di superficie, evidenziato mediante colorazione con anticorpi anti-IgG umana marcati con fluorocromo, si correla con la produttività di anticorpi della cellula. Come mostrato qui per le prime due linee cellulari ottenute dalla popolazione cellulare con elevata espressione di anticorpi di superficie, la produttività specifica è risultata compresa tra 50 e 70 picogrammi per cellula al giorno.Al contrario, la produttività anticorpale era di circa 20 picogrammi per cellula al giorno per i due cloni migliori ottenuti dalla popolazione cellulare con bassa espressione superficiale di anticorpi. Inoltre, le linee cellulari sviluppate mediante sorting automatizzato sono più stabili rispetto alla produzione di anticorpi rispetto a quelle clonate mediante diluizione limitante manuale. La produttività specifica del clone migliore, clone uno, ottenuto mediante diluizione limitante manuale, è diminuita da circa 30 PCD a circa 10 PCD dopo essere stato coltivato per 80 raddoppiamenti cellulari.D'altra parte, il sottoclone superiore generato mediante il clone due, ordinato per fax, è stato in grado di mantenere la produttività specifica intorno a 20 PCD per almeno 100 raddoppi cellulari. L'identificazione del sito di integrazione del transgene nel cromosoma cellulare mediante ibridazione fluorescente in situ ha dimostrato che il clone uno è una popolazione mista di fenotipo A e fenotipo B. Al contrario, il clone ordinato per fattore è apparso come una popolazione più omogenea, con il 99,5% delle cellule di fenotipo A. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sviluppare linee cellulari produttive per la produzione di proteine terapeutiche.

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Presentiamo un approccio microfluidica per l'espressione di proteine ​​array. Il dispositivo consiste di migliaia di camere di reazione controllati da micro-valvole meccaniche. Il dispositivo microfluidica è accoppiato ad un microarray stampata libreria genetica. Questi geni sono poi trascritta e tradotta on-chip, risultante in un array proteico pronto all'uso sperimentale.

High-throughput generatore di espressione delle proteine ​​Utilizzando una piattaforma microfluidica

Nel periodo post-genomica umana, la disponibilità di proteine ​​ricombinanti in conformazione nativa è cruciale per la ricerca strutturali, funzionali e terapeutico e lo sviluppo. Qui viene descritto un test e larga scala sistema di espressione proteica in cellule renali embrionali umane 293T che possono essere utilizzati per produrre una varietà di proteine ​​ricombinanti.

Una piattaforma espressione conveniente e generale per la produzione di proteine ​​secrete da cellule umane

Abbiamo sviluppato una coltura cellulare automatizzata e piattaforma di interrogatorio per esperimenti di stimolazione cellulare micro-scala. La piattaforma offre un controllo semplice, versatile e preciso nel coltivare e stimolare le piccole popolazioni di cellule, e recuperando lisati per le analisi molecolari. La piattaforma è adatto a studi che impiegano cellule preziosi e / o reagenti.

Una piattaforma automatizzata versatile per micro-scala Cellulari esperimenti di stimolazione

I protocolli descritti consentono ai laboratori di eseguire colture di cellule staminali scalabili e aderenti ad alta produttività con un costo minimo di manodopera, esperienza e investimento in attrezzature utilizzando un robot programmabile per la manipolazione dei liquidi e piastre da 96 pozzetti.  Le iPSC sono passate più di 20 volte su questo sistema, hanno mantenuto la pluripotenza, cariotipi normali e si sono differenziate in cardiomiociti.

Scalabile piastra a 96 pozzetti Based iPSC cultura e di produzione utilizzando un sistema robotico Liquid Handling

Un protocollo dettagliato per il funzionamento simultaneo di 48 colture parallele sotto varie condizioni in un sistema di microbioreactor è presentato. Processo di coltura cellulare, raccolta e analisi di titolo dell'anticorpo successivi sono descritti.

Uso di High-Throughput Microbioreactor sistema automatizzato per la produzione del modello IgG1 in cellule CHO

L'automazione è fondamentale per la scalabilità e la gestione dei costi nella produzione di celle. Questo manoscritto descrive l'uso di un dispositivo di elaborazione cellulare centrifuga controil flusso per automatizzare lo scambio di buffer e le fasi di concentrazione cellulare per il bioprocesso su piccola scala.

Sistema automatizzato di centrifuga controflusso per l'elaborazione di celle su piccola scala

Mostriamo l'automazione delle colture di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) e delle differenziazioni neuronali compatibili con l'imaging e l'analisi automatizzati.

Produzione automatizzata di neuroni corticali e dopaminergici pluripotenti indotti dall'uomo con monitoraggio integrato delle cellule vive

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere la produzione su larga scala di cellule aderenti attraverso un sistema completamente chiuso basato su microcarrier solubili di grado GMP. La coltivazione di cellule staminali mesenchimali umane, cellule HEK293T e cellule Vero è stata convalidata e ha soddisfatto sia le richieste di quantità che i criteri di qualità per l'industria della terapia cellulare e genica.

Produzione di celle su larga scala basata su microcarrier porosi solubili di grado GMP

Questo articolo descrive in dettaglio il processo di produzione delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico per uso clinico, in particolare utilizzando un processore cellulare automatizzato in grado di eseguire la trasduzione virale e la coltivazione delle cellule T. Forniamo raccomandazioni e descriviamo le insidie che dovrebbero essere considerate durante lo sviluppo del processo e l'implementazione di uno studio clinico in fase iniziale.

Produzione di cellule T del recettore dell'antigene chimerico su un processore cellulare automatizzato

Questo protocollo documenta la fabbricazione e l'assemblaggio di SPOT, una piattaforma di coltura basata su scaffold ad alta produttività, nei formati da 96 e 384 pozzetti. Descrive inoltre in dettaglio il processo di semina per SPOT, sia manuale che utilizzando un gestore di liquidi disponibile in commercio.

Produzione riproducibile di SPOT come piattaforma di coltura basata su scaffold ad alta produttività

Questo protocollo descrive un metodo scalabile per l'espansione dei prodotti Adoptive Cell Therapies (ACT), ovvero le cellule Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T e le cellule Cytokine-Induced Killer (CIK), utilizzando dispositivi di espansione rapida permeabile ai gas (G-Rex), dimostrando una crescita efficiente e robusta in un contesto clinicamente rilevante.

Generazione efficiente e rapida di cellule killer indotte da CAR-T e citochine in dispositivi scalabili GMP

Scopri lo sviluppo di linee cellulari ad alta produttività per proteine terapeutiche utilizzando citometria a flusso e imaging automatizzato. Questo metodo migliora la stabilità e la riproducibilità nella produzione di biologici.

A High-throughput piattaforma automatica per lo sviluppo di linee cellulari di produzione per Therapeutics Proteine

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