A High-throughput piattaforma automatica per lo sviluppo di linee cellulari di produzione per Therapeutics Proteine

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare linee cellulari produttive per biologici con clonalità e alta produttività. Questo viene raggiunto innanzitutto trasfettando la cellula ospite con DNA che codifica per il gene di interesse. Il passaggio successivo della procedura consiste nell'isolare i cloni ad alta produzione mediante FACS, seguito dalla documentazione della formazione di colonie tramite l'immaginatore Clone Select.

L'ultimo passaggio consiste nel selezionare e isolare i cloni altamente produttivi. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la produzione di anticorpi in colture continue e in batch con alimentazione, mediante HPLC in fase inversa. Il video. La dimostrazione di questo metodo è fondamentale poiché le fasi di sorting e pcan 80 dgl sono difficili da apprendere a causa della complessità dell'allestimento richiesto; i seguenti scienziati di un laboratorio illustreranno queste procedure per la trasfezione delle cellule ospiti, lo sorting, Jason Sanders per la documentazione della formazione delle colonie e Russell Kan per il campionamento con TECAN.

E Eliza Per iniziare questa procedura, il giorno precedente alla trasfezione, seminare le cellule ospiti in un fiasco per colture cellulari con 15 millilitri di mezzo di crescita. Incubare le cellule in un'incubatrice a 37 gradi Celsius, con anidride carbonica al 7,5%. Il giorno successivo, preparare prima i complessi di trasfezione: diluire otto microgrammi di DNA in 800 microlitri di mezzo di crescita senza siero in un tubo sterile per microcentrifuga, mescolando delicatamente. Successivamente, diluire 40 microlitri di lip in 800 microlitri di mezzo di crescita senza siero in un tubo di polistirene.

Aggiungere il DNA diluito al Lipofectamine diluito. Mescolare delicatamente e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per preparare le cellule ospiti alla trasfezione. Rimuovere il mezzo di crescita dalle cellule e sostituirlo con 6,4 millilitri di mezzo di crescita senza siero.

Aggiungere 1,6 millilitri dei complessi di trasfezione al fiasco. Mescolare delicatamente oscillando il fiasco. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore con anidride carbonica per sei ore.

Dopo sei ore, aggiungere otto millilitri di mezzo di crescita al matraccio e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore a anidride carbonica durante la notte nel giorno successivo. Rimuovere il mezzo mediante aspirazione e aggiungere mezzo di crescita fresco al matraccio. Incubare nuovamente le cellule durante la notte dopo l'incubazione notturna.

Sostituire il mezzo di crescita con il mezzo di selezione. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore a biossido di carbonio per due o tre settimane. Due o tre settimane dopo la trasfezione, le cellule sono pronte per il clonaggio mediante citometria a flusso; staccare le cellule dalla fiasca e centrifugare a 800 giri al minuto per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Sospendere le cellule nel mezzo selettivo, integrato con albumina sierica bovina al 2%. Quindi aggiungere l'anticorpo anti-IgG umana marcatore con fluorocromo. Aggiungere una diluizione da uno a 20, incubare sul ghiaccio per 15-30 minuti e quindi lavare due volte con PBS freddo; infine sospendere le cellule in un volume di PBS 1x in un tubo di polipropilene.

Un esempio di cellule colorate è mostrato in questa immagine per un'ordinazione asettica su un BD FACS Aria. Preparare una piastra per colture cellulari a 96 pozzetti contenente 200 microlitri di mezzo di selezione in ogni pozzetto. Caricare asetticamente il tubo con le cellule e analizzare sul BD FACS Aria, registrando i risultati rispettivamente per cellule colorate e non colorate.

Impostare le porte e le impostazioni per ordinare singole cellule con il profilo di colorazione fluorescente desiderato nella piastra a 96 pozzetti; incubare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per due settimane. Ai giorni zero, tre, sette e tredici dopo l'ordinamento delle cellule, documentare la formazione di colonie nella piastra a 96 pozzetti mediante un clone select imager, per garantire la selezione di cloni derivati da una singola cellula, al fine di identificare e selezionare cloni altamente produttivi. Prima di tutto, registrare la posizione del campione nella piastra saggio ricevente a 96 pozzetti. Successivamente, utilizzare un sistema robotizzato di gestione dei liquidi per trasferire aliquote di 20 microlitri di sopranatante in ciascun pozzetto della piastra saggio a 96 pozzetti. La produzione di anticorpi nei campioni viene analizzata mediante un saggio sandwich.

ELISA per il rilevamento di IgG umana sul sistema di gestione dei liquidi nel modo seguente. Innanzitutto, i campioni e uno standard vengono caricati su piastre per saggio pre-codificate con rivestimento biologico anti-IgG umana. Le piastre vengono incubate a temperatura ambiente per due ore, seguite da tre lavaggi con PBS.

Successivamente, viene aggiunto alle piastre l'anticorpo secondario caprino anti-IgG umana coniugato con HRP, diluito 1:2000, e le piastre vengono incubate per un'ora a temperatura ambiente. Dopo un'ora, le piastre vengono lavate tre volte con PBS e quindi viene aggiunto il substrato A BTS.

Infine, le piastre vengono lette su un lettore di piastre utilizzando l'assorbanza a 405 nanometri per il rilevamento. Utilizzando questa piattaforma automatizzata, si è scoperto che il livello di anticorpi sulla superficie, indicato dalla colorazione con anticorpi anti-IgG umana marcati con fluorocromo, si correla con la produttività di anticorpi della cellula. Come mostrato qui per le prime due linee cellulari ottenute dalla popolazione cellulare con elevata espressione di anticorpi di superficie, la produttività specifica è variata da 50 a 70 picogrammi per cellula al giorno.

Al contrario, la produttività anticorpale era di circa 20 picogrammi per cellula al giorno per i due cloni migliori ottenuti dalla popolazione cellulare con bassa espressione di anticorpi sulla superficie. Inoltre, le linee cellulari sviluppate mediante sorting automatizzato sono più stabili rispetto alla produzione di anticorpi rispetto a quelle clonate mediante diluizione limitante manuale. La produttività specifica del clone migliore, clone uno, ottenuto mediante diluizione limitante manuale, è diminuita da circa 30 PCD a circa 10 PCD dopo essere stato coltivato per 80 raddoppiamenti cellulari.

D'altra parte, il sottoclone superiore generato mediante il clone due, ordinato per fax, è stato in grado di mantenere la produttività specifica intorno a 20 PCD per almeno 100 raddoppi cellulari. L'identificazione del sito di integrazione del transgene nel cromosoma cellulare mediante ibridazione fluorescente in situ ha dimostrato che il clone uno è una popolazione mista di fenotipo A e fenotipo B. Al contrario, il clone ordinato per fattore è risultato essere una popolazione più omogenea, con il 99,5% delle cellule di fenotipo A. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sviluppare linee cellulari produttive per la produzione di proteine terapeutiche.