Estrazione di esosomi basata su biglie magnetiche: una tecnica per isolare esosomi specifici dai biofluidi

Gli esosomi sono strutture vescicolari extracellulari secrete dalle cellule nei biofluidi. Per catturare esosomi specifici dai biofluidi, iniziare prendendo perle magnetiche rivestite di streptavidina in un tubo.

A questo tubo, aggiungere anticorpi anti-umani biotinilati. La biotina presente sugli anticorpi ha un'elevata affinità per la streptavidina presente sulle microsfere magnetiche. Ciò si traduce nella coniugazione degli anticorpi con le microsfere magnetiche.

Quindi, aggiungere una soluzione bloccante ricca di proteine al tubo contenente le microsfere magnetiche marcate con anticorpi. Le proteine nella soluzione bloccante si legano ai siti liberi sulle biglie magnetiche e aumentano la specificità del legame degli esosomi.

Ora, integra la provetta con un campione di biofluido ricco di esosomi. Incubare la provetta con agitazione. Gli esosomi nel biofluido mostrano specifici recettori di superficie, che li aiutano a legarsi agli anticorpi attaccati alla superficie delle perle magnetiche.

Quindi, posizionare il tubo in un campo magnetico. Sotto l'influenza del campo magnetico, le perle magnetiche legate all'esosoma si attaccano alla superficie del tubo. Quindi, utilizzando una micropipetta, aspirare il biofluido rimanente dalla provetta.

Infine, rimuovere il tubo dal campo magnetico e aggiungere un tampone adatto per eluire le perle legate all'esosoma. Queste perle legate agli esosomi possono essere utilizzate per ulteriori analisi a valle.

Risospendere una soluzione madre contenente 10 microgrammi per millilitro di microparticelle magnetiche rivestite di streptavidina e aggiungere 5 microlitri della soluzione a una provetta da microcentrifuga contenente 495 microlitri di PBS. Per lavare le perline, per prima cosa, posizionare il tubo su una griglia magnetica per 1 minuto e rimuovere con cura il tampone senza disturbare le perline.

Quindi, trasferire la provetta su un rack non magnetico. Aggiungere 500 microlitri di PBS e pipettare per lavare le perline. Fallo per un totale di tre volte. Dopo il lavaggio finale, risospendere le perle in 490 microlitri di PBS e quindi aggiungere 5 microlitri di anticorpo CD63 anti-umano di topo biotinilato da una soluzione madre da 1 milligrammo per millilitro.

Miscelare la soluzione mediante pipettaggio. Programmare un rotatore di campioni per la rotazione reciproca a 90 gradi per 5 secondi e la vibrazione a 5 gradi per 1 secondo. Posizionare i tubi nel rotatore ed eseguire il programma per 30 minuti a temperatura ambiente.

Quindi, trasferire le provette sulla rastrelliera magnetica per 5 minuti. Lavare le perle tre volte con 500 microlitri di PBS e poi risospenderle in 490 microlitri di PBS contenente caseina. Etichettare una provetta con l'identificazione del campione e quindi aggiungere 10 microlitri di campione.

Pipettare più volte per miscelare il campione con le perle coniugate con anticorpi. Quindi, trasferire le provette nel rotatore di campioni ed eseguire lo stesso programma per 2 ore a temperatura ambiente. Quindi, lavare le perle tre volte con 500 microlitri di un tampone Tris-cloridrato 1M utilizzando la griglia magnetizzata. Gli esosomi sono ora legati alle perle magnetizzate.