Coltura di salisfere dal tessuto delle ghiandole salivari: un metodo per sviluppare salisfere da cellule epiteliali derivate dalle ghiandole salivari umane

Le salisfere sono colture in vitro autoaggreganti di cellule epiteliali derivate dalla ghiandola salivare. Per coltivare le salisfere, iniziare prendendo il tessuto delle ghiandole salivari umane in una piastra di coltura.

Usando le forbici, tritare il fazzoletto in pezzi sottili. Successivamente, integrare questi pezzi con una soluzione di dissociazione contenente collagenasi ed enzimi dispasi e incubare. Questi enzimi digeriscono la matrice extracellulare presente nel tessuto.

Inoltre, triturare per omogeneizzare il tessuto. Questo passaggio rilascia le cellule epiteliali e i globuli rossi nella soluzione. Quindi, utilizzare un colino cellulare e filtrare l'omogeneizzato di tessuto in una provetta conica fresca per rimuovere i pezzi di tessuto non digeriti e i detriti. Centrifuga per pellettare le cellule.

Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare nel tampone di lisi dei globuli rossi. Questo tampone rompe i globuli rossi presenti nella sospensione cellulare.

Ora, centrifugare per pellettizzare le cellule epiteliali. Risospendere il pellet in un mezzo di crescita delle cellule epiteliali appropriato. Inoltre, preparare la piastra di coltura della salisfera rivestendo il suo pozzetto con una matrice di membrana basamentale liquefatta o BMM. Incubare per consentire alla matrice di solidificarsi.

Infine, aggiungere la sospensione di cellule epiteliali nei pozzetti rivestiti di BMM. In presenza di terreni di crescita, le cellule epiteliali si attaccano allo strato di BMM e proliferano in salisfere sferiche.

Entro due-quattro ore dalla rimozione dal paziente, su una piastra di coltura, utilizzare forbici da dissezione sterilizzate in autoclave e pinze chirurgiche per tritare il tessuto delle ghiandole salivari in pezzi sottili delle dimensioni di 1-2 millimetri. Aggiungere 6 millilitri della soluzione di dispasi/collagenasi al tessuto tritato. Quindi, incubare a 37 gradi Celsius per circa 30 minuti a un'ora.

Disgregare il tessuto pipettandolo con la pipetta sierologica da 5 millilitri, da 15 a 20 volte. Incubare a 37 gradi Celsius per altri 30 minuti a un'ora. Ripetere la fase di pipettaggio e incubazione altre due o tre volte o fino a quando il tessuto assomiglia a un impasto liquido e può passare facilmente attraverso l'apertura della pipetta.

Per rivestire i pozzetti con BMM, pipettare lentamente 500 microlitri di BMM scongelato durante la notte in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Agitare lentamente la piastra per distribuire uniformemente il BMM sui pozzetti. Quindi, incubare le piastre rivestite a 37 gradi Celsius per almeno 15 minuti prima dell'uso per consentire al BMM di solidificarsi.

Trasferire la soluzione di dispasi/collagenasi contenente tessuto omogeneizzato in una provetta conica da 15 millimetri. Lavare una volta la parete della piastra con 6 millilitri di DPBS per trasferire le cellule rimanenti nella provetta conica. Quindi, attraverso un filtro cellulare a rete di nylon da 70 micrometri, filtrare l'omogenato in un nuovo tubo conico da 50 millimetri per rimuovere il tessuto non digerito.

Centrifugare le celle filtrate per 5 minuti a 500 x g. Aspirare il surnatante. Quindi, risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di tampone di lisi 1x RBC. Incubare per 5 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungere da 20 a 25 millimetri di DPBS per neutralizzare il tampone di lisi dei globuli rossi e ridurre al minimo la lisi delle cellule salivari.

Centrifugare per 5 minuti a 500 x g. Il pellet di globuli bianchi indica la lisi completa di tutti i globuli rossi. Se il pellet è di colore rosso, ripetere il trattamento con tampone di lisi RBC. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 o 2 millilitri di BEGM, quindi trasferire le cellule risospese su pozzetti rivestiti di BMM.

Incubare a 37 gradi Celsius. Una volta piastrate su BMM, le cellule si formeranno in strutture sferiche o salisfere in un periodo di due o tre giorni. Le cellule possono essere mantenute come salisfere per circa cinque-sette giorni prima che il BMM inizi a degradarsi, consentendo alle cellule di accedere e aderire alla plastica e crescere come un monostrato.