Colorazione del DNA extracellulare: un metodo per identificare il DNA extracellulare nelle sezioni di tessuto FFPE

Una cellula morente rilascia una frazione di DNA all'esterno della cellula chiamata DNA extracellulare. Per colorare il DNA extracellulare, iniziare prendendo una sezione di tessuto inclusa in paraffina fissata in formalina, o FFPE, su un vetrino. Riscaldare il vetrino per la durata desiderata. Ciò facilita l'adesione del tessuto sulla superficie del vetrino e ammorbidisce la paraffina circostante.

Immergere il vetrino nel liquido di deparaffinazione per sciogliere completamente lo strato di paraffina attorno al tessuto. Quindi, immergere il vetrino in concentrazioni decrescenti di etanolo per reidratare il tessuto deparaffinizzato. Dopo la reidratazione, immergere il vetrino in una soluzione bollente per il recupero dell'antigene. Questo trattamento smaschera gli epitopi che sono stati alterati durante il processo di fissazione.

Sovrapporre il vetrino con anticorpi primari e lasciarli legare a specifici epitopi non mascherati presenti sulla cellula. Quindi, aggiungere gli anticorpi secondari marcati in fluorescenza, che si legano agli anticorpi primari. Immergere il vetrino nella soluzione Sudan Black per ridurre l'autofluorescenza di fondo.

Infine, posizionare una goccia di terreno di montaggio integrato con DAPI sulla sezione di tessuto e sigillarla con un vetrino coprioggetti. Incubare per consentire alle molecole DAPI di colorare il DNA. Visualizzare la sezione di tessuto preparata utilizzando un microscopio a fluorescenza. Gli epitopi marcati in fluorescenza nella cellula aiutano a differenziare il DNA nucleare presente all'interno della cellula dal DNA extracellulare.

Per la colorazione extracellulare del DNA, in primo luogo, riscaldare i campioni di interesse nel rack per vetrini a 60 gradi Celsius per 60 minuti prima di immergere i vetrini in due cambi di solvente di 40 minuti in una cappa aspirante. Dopo la seconda immersione, reidratare i campioni due volte in etanolo al 100% e una volta in etanolo al 70% per 5 minuti per trattamento.

Dopo l'ultimo trattamento, utilizzare le pinze per posizionare i vetrini nella soluzione bollente di recupero dell'antigene in una pentola a pressione alla massima potenza per 10 minuti. Dopo aver smascherato gli epitopi dell'antigene, trasferisci la pentola a pressione dal fuoco in un lavandino e fai scorrere immediatamente l'acqua fredda del rubinetto sul coperchio.

Lasciare equilibrare i vetrini per 20 minuti nella soluzione di recupero dell'antigene prima di lavare i campioni due volte in PBS 0,01 molare su un agitatore orbitale per 5 minuti per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, utilizzare una penna idrofobica per disegnare cerchi attorno ai campioni di tessuto renale e bloccare qualsiasi colorazione non specifica con 60 microlitri di siero di pollo al 10% in albumina sierica bovina al 5% per 30 minuti a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione, sostituire con cura la soluzione bloccante con 60 microlitri dell'anticorpo primario di interesse in una camera di umidità durante la notte a 4 gradi Celsius. La mattina successiva, lavare i vetrini su uno shaker orbitale in PBS per 2 minuti per lavaggio prima di aggiungere 60 microlitri di un anticorpo secondario coniugato con fluorofori appropriato a ciascun vetrino per un'incubazione di 40 minuti a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione, lavare i vetrini in PBS come dimostrato, seguito da un trattamento in Sudan Black allo 0,3% in etanolo al 70% per spegnere qualsiasi potenziale autofluorescenza indotta dalla formalina. Dopo 30 minuti, lavare i vetrini in acqua di rubinetto per rimuovere eventuali precipitati e immergere i vetrini in PBS per 10 minuti per prevenire la formazione di ulteriori precipitati di Sudan Black.

Al termine dell'incubazione, montare i vetrini su vetrini confocali con gocce da 360 microlitri di soluzione di montaggio integrate con DAPI e sigillare i vetrini coprioggetti con smalto per unghie. Lasciare indurire i vetrini per 24 ore a temperatura ambiente. Conservarli a 4 gradi Celsius al riparo dalla luce fino all'imaging mediante microscopia a scansione laser confocale secondo i protocolli standard.