Microiniezione endovenosa di nefrotossine nell'embrione di zebrafish: una tecnica per rilasciare agenti nefrotossici nel flusso sanguigno dell'embrione di zebrafish

La microiniezione endovenosa facilita la somministrazione di molecole di interesse nel flusso sanguigno di un animale ricevente. Per somministrare le nefrotossine in un embrione di zebrafish, per prima cosa, preparare una concentrazione appropriata della soluzione di nefrotossine desiderata.

Utilizzando una punta di caricamento in gel fine, caricare questa soluzione di nefrotossine in un ago per microiniezione con una punta angolare affilata. Sospendi l'ago verticalmente per consentire alla soluzione di nefrotossine di riempire la punta dell'ago per gravità. Ora, fissare l'ago per microiniezione caricato nel supporto di un micromanipolatore.

Successivamente, trasferire un embrione di zebrafish anestetizzato nello stampo prefabbricato per microiniezione. Allineare l'embrione nello stampo con la testa orientata all'interno del pozzetto e la coda fuori dal pozzetto, migliorando l'accessibilità alla coda per la microiniezione. Quindi, posiziona con precisione la punta dell'ago vicino all'embrione.

Iniettare la soluzione di nefrotossine nella vena caudale dell'embrione. Gli agenti nefrotossici iniettati si diffondono attraverso la circolazione e raggiungono organi distanti come il rene. Ritrarre delicatamente l'ago. Trasferisci l'embrione in una capsula fresca contenente il terreno embrionale e lascialo riprendere. Incubare l'embrione per una durata specifica.

Entro poche ore dall'iniezione, le nefrotossine si accumulano nel rene e causano danni, portando a un declino della funzione renale.

Il giorno dell'iniezione, preparare la soluzione di nefrotossine desiderata con l'apposito controllo del veicolo. Vorticare o mescolare delicatamente. Successivamente, controllare i lati del tubo e la parte superiore della colonna d'acqua per assicurarsi che i farmaci siano disciolti in soluzione.

Caricare un ago per microiniezione tagliato con 2 o 3 microlitri di nefrorotossina infilando una punta di caricamento in gel sottile nella parte posteriore dell'ago e sospendere l'ago verticalmente con un pezzo di nastro adesivo per consentire alla soluzione di riempire la punta dell'ago tagliata per gravità.

Una volta che la punta dell'ago è piena, fissare l'ago caricato nel micromanipolatore. Testare il volume di microiniezione posizionando una goccia di olio minerale su un vetrino micrometrico e iniettare nell'olio per valutare la dimensione delle goccioline.

Successivamente, rimuovi la capsula degli embrioni dall'incubatrice e anestetizzali aggiungendo 5 millilitri di tricaina allo 0,2% alla capsula dell'embrione. Successivamente, trasferire gli embrioni nello stampo ad iniezione con una pipetta di trasferimento. Manovra ogni embrione in un pozzetto diverso dello stampo, posizionando la testa nella zona più profonda del pozzetto in modo che il tronco poggi lungo la depressione e la coda sporga da esso.

Ora, inserisci l'ago riempito nel micromanipolatore e posiziona la punta dell'ago accanto a un embrione. Inserire delicatamente l'ago nella vena caudale per la microiniezione.

La fase più critica della procedura è la microiniezione. Per garantire il successo, l'ago deve essere tagliato ad angolo acuto e deve essere spostato con cautela in posizione accanto all'embrione.

Se l'iniezione ha successo, dovresti vedere il liquido entrare in circolo. La co-iniezione del nefrotossico con destrano coniugato fluorescente consentirebbe al ricercatore di verificare l'avvenuta iniezione dopo la procedura. Successivamente, rimuovi delicatamente l'ago dall'embrione.

Trasferire l'embrione in un piatto pulito e risciacquare per rimuovere la tricaina con E3/PTU fresco. Quindi, incubare l'embrione fino al punto temporale desiderato per valutare la morfologia, che può essere documentata mediante fotografia in mezzi di montaggio in metilcellulosa o processo per l'analisi sperimentale come desiderato.

Si noti che il recupero degli embrioni deve essere valutato ogni 12-24 ore dopo l'iniezione per determinare la percentuale di individui con edema, che comunemente indica un danno renale.