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0 visualizzazioni • 2:54 min. • April 30th, 2023
Iniziare prelevando una piastra a pozzetti multipli contenente cellule aderenti.
Trattare queste cellule con un terreno contenente timidina triziata, una versione radioattiva della timidina, e incubarle.
Durante l'incubazione, le cellule che si replicano attivamente incorporano timidina radioattiva. Questa timidina si accoppia con l'adenosina, generando DNA radiomarcato nelle cellule proliferanti.
Rimuovere il materiale esaurito dai pozzetti. Aggiungere un tampone di lisi per lisare le cellule e rilasciare il DNA nella sospensione.
Preparare l'assemblaggio della mietitrice di cellule posizionando i tubi di raccolta della mietitrice sopra i pozzetti della micropiastra.
Applicare una pressione di aspirazione per consentire l'aspirazione del DNA sospeso dai pozzetti. Questo DNA si deposita sulla carta da filtro, formando macchie specifiche.
Ritaglia le cartucce di carta da filtro con macchie di DNA. Trasferire questi chads singolarmente in fiale di scintillazione.
Sovrapporre la carta da filtro con un cocktail a scintillazione. Posizionare la fiala in un contatore a scintillazione liquida.
All'interno del contatore, il DNA marcato emette energia per decadimento radioattivo. Questa energia viene assorbita dai componenti del cocktail di scintillazione. Alla fine, i componenti del cocktail iniziano a trasferire gli impulsi, che a loro volta vengono assorbiti dal sensore.
La quantità di radioattività rilevata determina l'entità della divisione cellulare.
Piastra di 100.000 cellule in pozzetti triplicati in una piastra a 24 pozzetti. Dopo 46 ore, aggiungere la timidina triziata al terreno di coltura e incubare a 37 gradi Celsius per 2 ore.
Quindi, dopo aver rimosso il terreno, aggiungere 300 microlitri di tripsina-EDTA preriscaldata allo 0,25% e incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius per rompere le cellule e rilasciare il DNA. Quindi, accendere la raccoglitrice di cellule e pompare.
Posizionare la carta da filtro nella raccoglitrice di cellule. Continuare a raccogliere le provette della raccoglitrice di cellule in un vassoio vuoto vuoto. Quindi, premere il prelavaggio per bagnare la carta da filtro. Posizionare le provette di raccolta nei pozzetti del campione e iniziare.
Utilizzare una fonte di luce calda per asciugare la carta da filtro e disporre le fiale corrispondenti sul vassoio. Perforare i pezzi di carta nelle fiale e poi aggiungere 2 millilitri di cocktail di scintillazione liquida a ciascuna fiala.
Incubare le fiale per 1 ora nel contatore a scintillazione prima di utilizzare la macchina per ottenere i conteggi al minuto di ciascun campione, che riflettono la sintesi attiva del DNA.