Saggio della neurosfera NPC: un test in vitro per valutare la risposta migratoria delle cellule precursori neurali della neurosfera

Le neurosfere sono aggregati sferici non aderenti di cellule precursori neurali o NPC.

Quando vengono piastrate in specifiche condizioni di coltura aderenti, le NPC possono migrare spontaneamente fuori dalla neurosfera.

Per valutare la risposta migratoria delle NPC, in primo luogo, preparare una sospensione di NPC della densità desiderata in un mezzo adatto.

Quindi, seminare la sospensione cellulare in una piastra di coltura contenente terreno di coltura e incubare.

I fattori di crescita specifici nei terreni supportano la proliferazione delle cellule. Inoltre, l'assenza di un substrato di rivestimento mantiene le cellule sospese nei terreni, facilitando la formazione di aggregati cellulari 3D chiamati neurosfere.

Al raggiungimento della dimensione desiderata, raccogliere le neurosfere.

Centrifugare e risospendere il pellet di neurosfera nel terreno diluito.

Quindi, placcare la sospensione della neurosfera in una piastra rivestita di matrice extracellulare contenente terreno diluito e incubare.

Durante la coltura, le neurosfere aderiscono alla matrice extracellulare.

Nel corso del tempo, a causa dei costituenti della matrice extracellulare, alcune NPC iniziano a migrare lontano dal nucleo della neurosfera.

Ora rimuovi il supporto e ripara le celle.

Cattura immagini a contrasto di fase delle neurosfere che mostrano la migrazione cellulare.

Utilizzando un software adatto, misurare l'area della neurosfera totale e la massa cellulare interna.

Infine, sottrarre l'area della massa cellulare interna dall'area totale della neurosfera per calcolare la migrazione media degli NPC dalla neurosfera.

Per formare la neurosfera, pipettare 1 millilitro di mezzo di espansione al 100% in un piatto da 35 millimetri senza alcun substrato di rivestimento. Quindi, aggiungi un milione di cellule precursori neurali in ciascuna di queste piastre e incuba la piastra a 37 gradi Celsius per 48-96 ore.

Per preparare la piastra alla migrazione della neurosfera, sciogliere le aliquote di gel che imitano la MEC in 6 millilitri di terreno di espansione al 30%. Aggiungere 1 millilitro di gel ECM-mimic con il 30% di terreno di espansione in un singolo pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Per impiattare le neurosfere, utilizzare una pipetta per raccogliere le cellule nel terreno dal piatto da 35 millimetri e trasferirle in un tubo conico. Quindi, far girare il tubo a 100 x g per pellettare le neurosfere. Quindi, risospendere il pellet in 1-3 millilitri di terreno di espansione preriscaldato al 30%.

Quindi, pipettare 200 microlitri di neurosfere risospese nella piastra a 6 pozzetti contenente il gel ECM-mimic con il 30% di mezzo di espansione e far oscillare la piastra. Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 48 ore. Aspirare il gel che imita la MEC con il 30% di mezzo di espansione e poi fissare le cellule per 30 minuti utilizzando paraformaldeide al 4%.

Per analizzare le neurosfere, acquisire immagini utilizzando le impostazioni di contrasto di fase con ingrandimento 10X. Utilizza il software NIH ImageJ per misurare la migrazione media delle neurosfere. Su ImageJ, utilizzare lo strumento linea a mano libera per tracciare il contorno esterno della neurosfera.

Quindi, utilizzare la funzione di misurazione per calcolare l'area della traccia e tracciare la massa cellulare interna della sfera. Sottrarre la massa cellulare interna dall'area totale della neurosfera per quantificare la migrazione media.