Isolamento degli astrociti: un metodo per ottenere una preparazione pura di astrociti corticali di topo

La coltura in vitro degli astrociti aiuta a studiare il ruolo biologico degli astrociti, le cellule cerebrali più abbondanti.

Inizia con un cervello di topo neonatale posto sotto un microscopio da dissezione.

Rimuovere i bulbi olfattivi e il cervelletto.

Eseguire un'incisione della linea mediana tra i due emisferi per separare la corteccia.

Rimuovere le meningi per evitare la contaminazione nella coltura degli astrociti da fibroblasti e cellule meningee.

Trasferisci gli emisferi della corteccia in un mezzo ghiacciato e tritali in piccoli pezzi.

Raccogli i pezzi corticali in una provetta contenente tripsina. La tripsina, un enzima proteasi, digerisce le proteine di adesione cellulare, facilitando la separazione cellulare.

Centrifuga per pellettare il tessuto digerito.

Rimuovere il surnatante e aggiungere un mezzo astrocitario al pellet. Pipettare energicamente per rilasciare una popolazione cellulare mista di astrociti, microglia e cellule precursori degli oligodendrociti o OPC.

Seminare questa sospensione cellulare in un pallone di coltura tissutale rivestito di polilisina e incubare.

Le cellule caricate negativamente si attaccano alla polilisina caricata positivamente e crescono su tutta la superficie per formare uno strato confluente.

Agitare il pallone per staccare le microglia e gli OPC legati in modo lasco. Rimuovere il surnatante contenente le cellule staccate.

Aggiungere la tripsina allo strato di astrociti. Raccogliere le celle e centrifugare.

Risospendere il pellet e dividere gli astrociti in più fiasche.

Infine, valutare la purezza della coltura di astrociti mediante immunocolorazione di marcatori specifici per le cellule.

Trasferisci la capsula contenente il cervello in uno stereomicroscopio. Successivamente, per isolare le cortecce, afferrare l'estremità posteriore di ciascun cervello con una pinza sottile ed eseguire un'incisione della linea mediana tra gli emisferi.

Quindi, inserire una seconda serie di pinze nel solco creato e staccare la struttura a placche della corteccia dal resto del cervello.

Una volta che tutte le cortecce sono state isolate, staccare con cura le meningi dalla corteccia tirando con la pinza fine. Questo passaggio evita la contaminazione della coltura finale degli astrociti da parte di cellule meningee e fibroblasti.

Trasferire gli emisferi corticali preparati in un secondo piatto riempito con HBSS freddo e metterli sul ghiaccio. Continuare di conseguenza con tutte e quattro le cortecce. Infine, taglia ogni emisfero in quattro-otto piccoli pezzi usando lame affilate.

In condizioni sterili, trasferire i pezzi di corteccia in un tubo Falcon da 50 millilitri e aggiungere HBSS a un volume finale di 22,5 millilitri. Quindi, aggiungere 2,5 millilitri di tripsina al 2,5%.

Riposizionare il tappo, mescolare e incubare il fazzoletto nel bagnomaria a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Mescolare agitando ogni 10 minuti. Quindi, dopo aver centrifugato per 5 minuti a 300 x g per pellettare i pezzi di tessuto della corteccia, decantare accuratamente il surnatante.

Aggiungere 10 millilitri di terreno di placcatura per astrociti al pellet e utilizzare una pipetta da 10 millilitri per pipettare energicamente il terreno contenente il tessuto su e giù da 20 a 30 volte fino ad ottenere una sospensione di una singola cellula.

Successivamente, aggiungere il terreno di placcatura degli astrociti fino a un volume finale di 20 millilitri e contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato secondo le procedure standard.

Una preparazione di quattro cortecce di cuccioli di topo dovrebbe produrre da 10 a 15 volte 10 alla sesta cellula singola dissociata. Infine, aspirare la poli-D-lisina da un pallone precedentemente preparato e trasferire la sospensione cellulare dissociata nel pallone.

Incubare la coltura a 37 gradi Celsius nell'incubatore di coltura tissutale per 2 giorni e poi cambiare il terreno. I media devono quindi essere cambiati ogni 3 giorni.

L'astrocita dovrebbe apparire confluente con uno strato sovrastante di microglia dopo 7-8 giorni di coltura. A questo punto, posizionare il pallone T75 su un agitatore orbitale impostato a 180 rotazioni al minuto per 30 minuti per rimuovere la microglia.

Scartare il surnatante contenente microglia o centrifugarlo e impiattare per la coltura. Quindi, aggiungere 20 millilitri di terreno di coltura di astrociti freschi e continuare agitando il pallone a 240 giri/min per 6 ore per rimuovere le cellule precursori degli oligodendrociti.

Poiché alcune OPC non si staccano completamente dallo strato di astrociti, continuare a agitare energicamente con la mano per 1 minuto per prevenire la contaminazione da OPC. Ancora una volta, scartare il surnatante o girarlo su una piastra per coltivare gli OPC.

Sciacquare due volte lo strato confluente rimanente di astrociti con PBS. Aspirare il PBS e aggiungere 5 millilitri di tripsina-EDTA. Incubare nell'incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius.

Controlla il distacco degli astrociti ogni 5 minuti e rafforza il distacco degli astrociti colpendo la fiaschetta contro il palmo della mano due o tre volte.

Una volta che gli astrociti si sono staccati dal pallone, aggiungere 5 millilitri di terreno di coltura per astrociti. Centrifugare le cellule a 180 x g per 5 minuti, aspirare il surnatante e aggiungere 40 millilitri di terreno di coltura per astrociti fresco.

Una fiaschetta T75 di cellule corticali miste dovrebbe produrre circa 1 volte 10 alle seste cellule arricchite per gli astrociti dopo il primo passaggio.