Barriera tumorale emato-encefalica o modello BBTB: un adattamento del modello di barriera emato-encefalica o BBB per valutare la somministrazione di terapie al tumore

La barriera emato-encefalica, o BBB, è una barriera selettiva di cellule endoteliali e cellule cerebrali come gli astrociti che regola il trasporto di sostanze tra il sangue e il cervello.

Per sviluppare un modello BBB, capovolgere un inserto a membrana sul coperchio di una piastra di coltura.

Semina gli astrociti sulla membrana. Posizionare la piastra di coltura sopra l'inserto e incubare.

Questo intrappola gli astrociti tra la membrana e la superficie del pozzo.

Capovolgere la piastra per portare gli astrociti sul fondo e aggiungere un mezzo adatto al pozzetto.

All'inserto, aggiungere cellule endoteliali che esprimono proteine di giunzione stretta ottimali che migliorano i contatti cellula-cellula necessari per la formazione della barriera.

Incubare per consentire alle cellule endoteliali di aderire alla membrana.

Rimuovere il terreno esaurito e trasferire l'inserto in un altro terreno di coltura per astrociti ben contenuto e privo di fattore di crescita.

Successivamente, aggiungere all'inserto un terreno di coltura endoteliale privo di fattore di crescita e incubare.

L'assenza di fattori di crescita inibisce la divisione cellulare, preservando i contatti cellula-cellula e stabilizzando le proprietà di barriera.

Le cellule endoteliali e gli astrociti interagiscono per formare una membrana basale con giunzioni strette come la BEE.

Successivamente, semina bene gli sferoidi del glioma in una nuova coltura.

Trasferire il modello BBB su questi sferoidi e incubare per formare la barriera tumorale emato-encefalica o modello BBTB.

Aggiungere molecole bersaglio al modello BBTB per valutare la loro consegna al sito tumorale.

Sotto una cappa di coltura cellulare sterile, lavare accuratamente gli astrociti coltivati con 5 millilitri di PBS sterile. Utilizzare una pompa a vuoto per scartare delicatamente il PBS e aggiungere 2 millilitri di reagente di dissociazione cellulare per 5 minuti per staccare le cellule.

Quindi, aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura cellulare di astrociti completo sterile al recipiente per inibire l'attività del reagente di dissociazione cellulare. Utilizzare una pipetta sierologica sterile per trasferire le cellule staccate dal recipiente in una provetta sterile da 15 millilitri.

Centrifugare a 250 x g per 3 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, disponi gli inserti. Utilizzare una pinza sterile per posizionare gli inserti con il lato cerebrale rivolto verso l'alto sul coperchio di una piastra sterile a 6 pozzetti.

Al termine della centrifugazione, scartare con cura il surnatante dalla sospensione cellulare e risospendere il pellet di astrociti in 1 millilitro di ABM plus pipettando delicatamente il pellet sulla parete delle provette fino a cinque volte.

Quindi, contare le cellule e regolare la densità della sospensione cellulare a 150.000 cellule in 400 microlitri di ABM plus per inserto. Posizionare questa sospensione cellulare al centro del lato cerebrale della membrana dell'inserto e stenderla con cura usando la forza capillare con una punta di pipetta sterile.

Con il lato cervello degli inserti ancora rivolto verso l'alto, riposizionare la piastra a 6 pozzetti sugli inserti. Posizionare la piastra e gli inserti con il lato cerebrale rivolto verso l'alto in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per consentire l'adesione cellulare.

Successivamente, riportare la piastra a 6 pozzetti nella sua posizione normale con gli inserti ora rivolti verso l'alto. Aggiungere il terreno e continuare l'incubazione come indicato nel protocollo di testo. Sotto una cappa di coltura cellulare sterile, lavare accuratamente le cellule endoteliali in coltura con 5 millilitri di PBS sterile.

Utilizzare una pompa a vuoto per scartare delicatamente il PBS e aggiungere 2 millilitri di reagente di dissociazione cellulare per 5 minuti per staccare le cellule. Quindi, aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura cellulare endoteliale completo sterile al recipiente per inibire l'attività del reagente di dissociazione cellulare.

Utilizzare una pipetta sierologica sterile per trasferire le cellule staccate dal recipiente in una provetta sterile da 15 millilitri. Centrifugare a 250 x g per 3 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, scartare il surnatante e risospendere il pellet di cellule endoteliali in 1 millilitro di EBM plus pipettando lentamente la sospensione cellulare sulla parete del tubo fino a cinque volte.

Contare le cellule e regolare la densità della sospensione cellulare a 200.000 cellule in 2,5 millilitri di coltura cellulare endoteliale, priva di siero e fattore di crescita endoteliale vascolare-A per inserto. Recuperate la piastra contenente gli inserti.

Eliminare con cura il terreno dal lato del sangue e sostituirlo con i 2,5 millilitri di sospensione di cellule endoteliali. Quindi, rimettere la piastra nell'incubatrice e lasciarla per una notte per consentire alle cellule endoteliali di aderire alla membrana.

Il giorno successivo, preparare una piastra a 6 pozzetti trasferendo 3 millilitri di ABM meno preriscaldato in ciascun pozzetto. Utilizzando una pinza sterile, maneggiare gli inserti per scartare con cura il terreno completo endoteliale dal lato del sangue e posizionare l'inserto nella nuova piastra contenente ABM minus. Quindi, aggiungi 2,5 millilitri di EBM in meno.

Lasciare gli inserti nell'incubatrice con il minimo disturbo fisico o variazione di temperatura per 5 giorni. Il giorno del trasferimento, sostituire il supporto. Per l'imaging in immunofluorescenza, posizionare fino a quattro vetrini coprioggetti rotondi sterili in borosilicato in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, contenente 2 millilitri di poli-D-lisina. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.

Nel frattempo, utilizzare una pipetta sierologica sterile per trasferire con cura le sfere tumorali dal recipiente di coltura cellulare a una provetta sterile da 15 millilitri. Centrifugare le sfere tumorali a 250 x g per 3 minuti. Scartare il surnatante e risospendere delicatamente le sfere in 1 millilitro di GBM meno.

Conta le cellule e regola la densità delle cellule a circa 10.000 sfere o 100.000 cellule per millilitro di GBM meno. Quindi, scartare la poli-D-lisina dai pozzetti e sciacquare i pozzetti tre volte con PBS sterile. Seminare ogni pozzetto della piastra con 3 millilitri di sospensione di sferoide tumorale e trasferire gli inserti con il BBTB mimic sulla sospensione di cellule tumorali.

Incubare per una notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per consentire ai siti del sangue e del tumore cerebrale del test di raggiungere l'equilibrio. Il giorno successivo, sostituire il terreno nel lato del sangue con EBM minus integrato con le molecole, i farmaci o le nanoparticelle di interesse.