Isolamento delle cellule cerebrali dalle larve di pesce zebra: una tecnica per ottenere neuroni, macrofagi e microglia intatti dal tessuto cerebrale del pesce zebra

Il cervello del pesce zebra è costituito da neuroni, cellule nervose che svolgono un ruolo di primo piano nell'elaborazione delle informazioni. Inoltre, comprende una popolazione di cellule immunitarie di supporto, tra cui macrofagi e microglia, che abitano lo spazio interneuronale.

Per isolare tutti questi tipi di cellule cerebrali da un pesce zebra, in primo luogo, prendi larve di pesce zebra anestetizzate in una capsula di Petri contenente terreni appropriati.

Visualizza il pesce zebra con uno stereomicroscopio e seziona le teste larvali sopra il sacco vitellino per mantenere intatto il cervello.

Trasferire le teste asportate in un omogeneizzatore riempito con materiale pre-raffreddato, posto su ghiaccio. La bassa temperatura aiuta a prevenire la degradazione delle cellule cerebrali.

Con un pestello, omogeneizzare il tessuto cerebrale del pesce zebra. L'omogeneizzazione disintegra la matrice extracellulare e avvia la dissociazione di neuroni, macrofagi e microglia dal tessuto cerebrale.

Questo passaggio separa anche la mielina, uno strato isolante ricco di lipidi, dai neuroni.

Passare l'omogeneizzato attraverso un colino per intrappolare i grandi grumi cellulari.

Centrifugare il filtrato per pellettizzare le cellule e i frammenti della guaina mielinica. Eliminare il surnatante contenente detriti.

Risospendere il pellet in un mezzo con gradiente di densità appropriato e sovrapporlo con un tampone.

Girare lungo il tubo a bassa velocità. I frammenti di mielina più leggeri formano una banda distinta all'interfaccia del tampone e del mezzo del gradiente di densità, mentre le cellule più dense si depositano sul fondo.

Aspirare gli strati superiori e risospendere le cellule cerebrali in un terreno fresco per un ulteriore utilizzo.

Aggiungere 1,5 millilitri di tricaina da 15 millimolari per 50 millilitri di terreno a 50 larve per preparare l'anestesia. Quindi, utilizzare una pipetta Pasteur da 3 millilitri per trasferire 10 larve alla volta in una capsula di Petri da 55 millimetri riempita con terreno E3 ghiacciato con tricaina per anestetizzarle terminalmente.

Sotto uno stereomicroscopio, allineare 10 larve al centro della capsula di Petri. Quindi, usando le forbici chirurgiche, sezionare le teste larvali sopra il sacco vitellino.

Con una pipetta Pasteur da 3 millilitri, prelevare tutte le teste e, con meno liquido possibile, trasferirle in un omogeneizzatore di vetro su ghiaccio contenente 1 millilitro di Media A ghiacciato.

Sostituire ogni piccola capsula di Petri contenente E3 ghiacciato più tricaina con una nuova ogni 30 minuti per garantire che la transezione venga eseguita in E3 freddo più terreno di tricaina.

Sostituisci il supporto A ghiacciato nell'omogeneizzatore di vetro quando il colore inizia a sbiadire. Una volta raccolto l'intero gruppo di testine, rimuovere tutto il Media A dall'omogeneizzatore di vetro e sostituirlo con 1 millilitro di Media A fresco ghiacciato.

Con l'omogeneizzatore ancora sul ghiaccio, usa un pestello aderente per distruggere il tessuto cerebrale eseguendo 40 cicli di frantumazione e giri per larve da 3 a 5 dpf e 50 colpi per larve da 7 e 8 dpf.

Quindi, aggiungere 2 millilitri di Media A alla sospensione cellulare per diluire le cellule e ridurre la loro agglomerazione con la mielina. Elimina l'agglomerazione cellulare facendo passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micron in un tubo di falco freddo da 50 millilitri su ghiaccio. Ripeti questo passaggio tre volte.

Trasferire aliquote da 1 millilitro di sospensione cellulare in provette fredde da 1,5 millimetri e farle girare a 300 x g e 4 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, utilizzando una siringa da 10 millilitri con l'ago da 23 G x 1", rimuovere il surnatante.

Con 1 millilitro di mezzo di gradiente di densità ghiacciato del 22%, delicatamente sovrapposto da 0,5 millilitri di 1x DPBS ghiacciato, risospendere delicatamente il pellet di celle. Far girare i tubi a 950 x g senza interruzioni e rallentare l'accelerazione a 4 gradi Celsius per 30 minuti.

Dopo la rotazione, scartare il mezzo del gradiente di densità DPBS e la mielina intrappolata nell'interfaccia. Quindi, utilizzare 0,5 millimetri di Media A con il 2% di NGS per lavare le cellule e centrifugare le provette a 300 x g a 4 gradi Celsius per 10 minuti.

Rimuovere quanto più surnatante possibile, quindi estrarre i pellet cellulari dalla stessa condizione sperimentale insieme in 1 millilitro di terreno A con il 2% di NGS.

Se le cellule di interesse esprimono una proteina fluorescente, far passare la sospensione cellulare attraverso un tappo di filtro cellulare da 35 micron e trasferirle in provette FACS fredde da 5 millilitri su ghiaccio al riparo dalla luce.