Generazione di cellule staminali neurali indotte (iNSC) da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMNC): una procedura basata sul virus Sendai per riprogrammare le PBMNC in iNSC

Per riprogrammare le cellule somatiche in cellule staminali neurali indotte o iNSCs, cellule staminali che possiedono un'elevata capacità di autorinnovamento e differenziazione, iniziare coltivando cellule mononucleate del sangue periferico in un terreno privo di siero per espandere gli eritroblasti.

Quindi, pipettare la sospensione di eritroblasto in una piastra di coltura. Trattare le cellule con il virus Sendai ricombinante o SeV. Questi virus codificano per la riprogrammazione dei fattori di trascrizione. Centrifugare per sedimentare le cellule e incubare.

Dopo la fusione di SeV con la membrana della cellula ospite, il genoma del virus subisce una trascrizione seguita da una traduzione nel citoplasma. L'espressione ectopica dei fattori di trascrizione innesca il processo di riprogrammazione cellulare senza integrare i geni nel genoma ospite.

Ora, centrifugare la coltura per rimuovere i virus. Risospendere le cellule trasdotte in un mezzo adatto, quindi procedere alla piastratura. Inoltre, centrifugare per rimuovere i detriti cellulari. Risospendere le cellule nel terreno iNSC.

Successivamente, seminare le cellule in una piastra rivestita di proteine. Le cellule si attaccano al rivestimento proteico della piastra. Integrare le cellule aderenti con terreni iNSC a giorni alterni. Dopo una settimana di coltura, sostituire i supporti esauriti con nuovi supporti iNSC ogni giorno.

I fattori di crescita e i costituenti chimici nei terreni mantengono l'auto-rinnovamento e supportano la pluripotenza di un sottogruppo di cellule trasdotte, riprogrammandole completamente in iNSCs. Nel corso del tempo, le cellule iniziano a formare colonie di iNSC. Seleziona le colonie desiderate per la coltivazione.

Il giorno 0, raccogliere le cellule in terreno MNC e trasferirle in una provetta conica da 15 millilitri. Dopo aver centrifugato le cellule a 200 x g per 5 minuti, aspirare il surnatante e risospendere le cellule con 1 millilitro di terreno MNC preriscaldato. Contare le cellule vitali con Trypan Blue e quindi risospenderle con terreno MNC preriscaldato fino a una concentrazione di 200.000 cellule per pozzetto in piastre a 24 pozzetti.

Scongelare i tubi rimossi dal deposito a meno 80 gradi Celsius contenenti il virus Sendai in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 5-10 secondi e poi lasciarli scongelare a temperatura ambiente. Una volta scongelati, metteteli subito sul ghiaccio. Aggiungete il virus Sendai scongelato ai pozzetti della piastra a 24 pozzetti con le multinazionali a una molteplicità di infezione di 10. Per facilitare l'adesione delle cellule, centrifugare le piastre a 1.000 x g per 30 minuti, dopodiché, posizionare le piastre nell'incubatore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica.

Il giorno 1, trasferire le cellule con il terreno in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Per staccare ulteriormente le cellule rimanenti, sciacquare i pozzetti con 1 millilitro di terreno MNC per pozzetto e aggiungere le cellule con terreno alla provetta. Dopo aver centrifugato questa sospensione cellulare a 200 x g per 5 minuti, aspirare il surnatante, risospendere le cellule con 500 microlitri di terreno MNC fresco preriscaldato e aggiungere a un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.

Il giorno 2, utilizzare 1 millilitro per pozzetto di poli-D-lisina e D-PBS precedentemente diluiti 50 microgrammi per microlitro per rivestire le piastre a 6 pozzetti per almeno 2 ore a temperatura ambiente. Aspirare la poli-D-lisina dalle piastre a 6 pozzetti e asciugare sul banco pulito verticale per circa 10 minuti. Quindi, aggiungere 1 millilitro per pozzetto di una laminina precedentemente diluita di 5 microgrammi per millilitro alle piastre a 6 pozzetti e incubare per 4-6 ore a 37 gradi Celsius per ricoprire. Lavare le piastre con D-PBS prima dell'uso.

Il giorno 3, piastra tutte le MNC trasdotte dal virus Sendai in terreno di cellule staminali neurali indotte su piastre a 6 pozzetti rivestite di poli-D-lisina. Nei giorni 5 e 7, aggiungere delicatamente 1 millilitro di terreno iNSC preriscaldato a 37 gradi Celsius a ciascun pozzetto delle piastre a 6 pozzetti.

Dal giorno 9 al giorno 28, sostituire il terreno con un terreno iNSC fresco e preriscaldato ogni giorno. Monitorare l'emergere delle colonie di iNSC e, in circa 2 o 3 settimane, raccogliere le colonie con morfologia appropriata utilizzando pipette di vetro bruciate. Quindi, trasferire ogni colonia in un pozzetto separato di una piastra a 6 pozzetti per l'espansione.