Preparazione dell'impalcatura seminata MSC: una tecnica per preparare l'impalcatura seminata con cellule staminali mesenchimali per l'impianto chirurgico in un modello murino

Le cellule tumorali producono fattori di homing chemiotattici per attirare le cellule staminali mesenchimali o MSC dai vasi sanguigni verso la posizione del tumore.

Per studiare l'effetto di queste cellule sulla crescita tumorale in vitro, iniziare prendendo un substrato di scaffold sterilizzato. Trasferirlo in una piastra a pozzetti contenente il supporto desiderato per pre-bagnare l'impalcatura. Posizionarlo su una superficie asciutta per rimuovere il materiale in eccesso che si attacca all'impalcatura per una migliore adesione delle cellule. Trasferire l'impalcatura parzialmente asciutta in un pozzo fresco. Semina una goccia di sospensione di MSC sull'impalcatura.

Inoltre, aggiungere altro terreno negli angoli del pozzetto per creare una camera di idratazione che impedisca l'evaporazione del terreno dalla goccia durante la successiva incubazione. Incubare per consentire alle MSC di aderire alla superficie dell'impalcatura. Capovolgere l'impalcatura per esporre la superficie non seminata. Pipettare una goccia fresca di sospensione di MSC su questo lato e lasciare che le MSC aderiscano.

Dopo che le MSC hanno aderito a entrambi i lati dell'impalcatura, coprirla con altro terreno assicurandosi che tutte le cellule siano a contatto con il terreno. Incubare fino a quando le MSC crescono e si infiltrano all'interno degli interstizi e dei pori dell'impalcatura. L'impalcatura con semina MSC è pronta per l'impianto chirurgico.

Preparare gli scaffold 48 ore prima dell'impianto nei topi tagliando prima gli scaffold in PLA in pezzi delle dimensioni di una cavità di resezione di circa 2 per 2 millimetri. Sterilizzare gli scaffold immergendoli in etanolo al 70% per 15 minuti. Dopo 15 minuti, immergere gli scaffold in PBS. Quindi, posizionare gli scaffold nel Dulbecco's Modified Eagle's Medium contenente il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina-streptomicina mentre si preparano le cellule per la semina.

Per preparare le cellule, in primo luogo, sollevare le MSC in coltura utilizzando lo 0,05% di tripsina. Incubare a 37 gradi Celsius per 5 minuti. Dopo l'incubazione, assicurarsi che le cellule si siano sollevate. Quindi, aggiungere DMEM al pallone per inattivare la tripsina. Quindi, trasferire il contenuto del pallone in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Quindi, pellettare 5 volte 10 al quinto MSC per ogni scaffold tramite centrifugazione a 100 x g per 5 minuti.

Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere le MSC in 5 microlitri di DMEM per 5 volte 10 fino alla quinta cellula. Quindi, rimuovere un'impalcatura dall'immersione in DMEM con una pinza e posizionarla sul coperchio della piastra a 6 pozzetti. Solleva l'impalcatura dal coperchio, lasciando dietro di sé una goccia di DMEM in eccesso. Riposizionare l'impalcatura sul coperchio in un nuovo luogo asciutto. Ripeti da tre a cinque volte. Quindi, posizionare l'impalcatura parzialmente essiccata in una nuova piastra a 6 pozzetti per la semina.

Un'impalcatura parzialmente essiccata fornisce risultati ottimali di semina cellulare. Se l'impalcatura è troppo bagnata, le celle scivoleranno via dall'impalcatura e aderiranno alla piastra sottostante. Se l'impalcatura deve asciugarsi, la gocciolina non si diffonderà sull'intera impalcatura, con conseguente scarsa distribuzione cellulare iniziale.

Usando una pipetta, mescolare delicatamente il tubo di MSC per omogeneizzare la sospensione poiché alcune cellule potrebbero essersi depositate sul fondo. Pipettare lentamente 2,5 microlitri di sospensione di MSC appena miscelata direttamente sullo scaffold, creando una piccola gocciolina sopra lo scaffold. Aggiungere 300 microlitri di DMEM ai bordi di ciascun pozzetto per evitare la rapida evaporazione della gocciolina cellulare. Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti, consentendo alle cellule di attaccarsi all'impalcatura.

Dopo l'incubazione, utilizzare una pinza per capovolgere delicatamente gli scaffold nella piastra a pozzetti. Semina 2,5 microlitri di sospensione di MSC appena miscelata per ottenere un totale di 5 volte 10 alla quinta cellula seminata per impalcatura. Dopo un'incubazione di 30 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi all'impalcatura, coprire gli scaffold in DMEM aggiungendo 2 millilitri a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti. Sollevare delicatamente le impalcature per consentire ai fluidi di fluire sotto di esse. Incubare a 37 gradi Celsius in questo stato per 48 ore prima dell'intervento di impianto.