Resezione tumorale guidata da fluorescenza e impianto di scaffold seminato con MSC in modello murino: una procedura chirurgica per fornire cellule staminali mesenchimali terapeutiche nella cavità di resezione del tumore cerebrale in un modello murino

Le cellule staminali mesenchimali o MSC possono essere geneticamente modificate per esprimere il ligando che induce l'apoptosi correlata al fattore di necrosi tumorale o TRAIL, che si lega a recettori specifici sulle cellule tumorali inducendo l'apoptosi.

Per somministrare queste MSC in un modello murino portatore di tumore, in primo luogo, preparare uno scaffold in biopolimero seminato con MSC che esprime TRAIL. Quindi, fissare un topo anestetizzato con tumore cerebrale marcato con fluorescenza su un telaio stereotassico. Il topo ha una finestra cranica prestabilita per l'accesso al cervello.

Mantieni la temperatura corporea del mouse con un termoforo. Sterilizzare il sito chirurgico e praticare un'incisione sulla linea mediana del cuoio capelluto. Rimuovere il grasso sottocutaneo per rivelare la finestra cranica. Staccare la dura madre dalla finestra, esponendo il tessuto parenchimale sottostante e il tumore.

Ora, sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza, visualizza il tumore fluorescente. Aspirare il tessuto tumorale fluorescente dal cervello. Lavare con soluzione fisiologica per ripristinare il pH fisiologico. Impiantare l'impalcatura seminata con MSC nella cavità di resezione. Applicare un agente emostatico adatto per fissare l'impalcatura in posizione. Chiudere l'incisione e consentire al topo di riprendersi.

Dopo l'impianto, le cellule tumorali all'interno dei focolai tumorali residui secernono fattori solubili, che facilitano la migrazione delle MSC dall'impalcatura verso le cellule tumorali. Le proteine TRAIL secrete dalle MSC si legano a specifici recettori sulle cellule tumorali, inducendo la morte cellulare apoptotica.

Inizia posizionando la cornice stereotassica sul tavolino di uno stereomicroscopio a fluorescenza da dissezione. Quindi, fissare il topo anestetizzato sul telaio stereotassico con l'alimentazione continua di anestesia inalatoria tramite un adattatore per cono nasale di isoflurano. Mantenere la temperatura corporea con un termoforo. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza della cornea. Quindi, sterilizzare il sito di incisione del cuoio capelluto con una serie di tre salviette alcoliche e tre salviette betadine.

Eseguire il test del riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi su ciascun arto e confermare la risposta negativa per garantire una corretta anestesia. Usando una pinza, pizzicare e sollevare delicatamente il cuoio capelluto. Dopo aver praticato un'incisione rostrale-caudale lineare della linea mediana con le forbici chirurgiche, irrigare il sito dell'incisione con PBS e rimuovere il grasso sottocutaneo con un applicatore a punta di cotone con un movimento circolare di spazzolatura.

Disporre la pelle in modo che la finestra cranica precedentemente stabilita sia completamente visibile. Usa un ago calibro 18 per forare delicatamente la dura madre appena all'interno dei bordi della finestra cranica. Ripetere fino a quando l'incisione non traccia completamente l'interno della finestra. Rimuovere la dura madre staccandola con una pinza fine, rivelando il parenchima e il tumore sottostanti.

Quindi, abbassa le luci della stanza e attiva la modalità di fluorescenza dello stereomicroscopio. Localizzare il tumore U87 mCherry e lucciola che esprime la luciferasi. Caricare un puntale per pipetta da 200 microlitri all'estremità del tubo di una pompa per vuoto. Quindi, accendere la pompa del vuoto. Resecare il tumore aspirando delicatamente il tessuto fluorescente fino a quando non rimane alcun segnale. Per controllare il sanguinamento, irrigare con PBS freddo e applicare una pressione costante con un applicatore con punta di cotone.

Utilizzare una combinazione di soluzione fisiologica, pressione costante con un applicatore con punta di cotone e/o un agente emostatico, come SURGICEL, per fermare l'emorragia prima di impiantare l'impalcatura. Se non adeguatamente controllato, può formarsi un ematoma potenzialmente pericoloso. Dopo la resezione, spegnere la pompa del vuoto e gettare il puntale della pipetta. Disattiva la fluorescenza e la stanza si illumina di nuovo. Immediatamente prima dell'impianto, immergere lentamente un'impalcatura in PLA seminata con MSC in PBS per rimuovere i terreni indesiderati e i componenti associati. Impiantare l'impalcatura nella cavità di resezione.

Se necessario, aggiungere 1 microlitro di fibrinogeno, seguito da 1 microlitro di trombina per fissare l'impalcatura in posizione. Con la dura madre rimossa e il lembo osseo dalla finestra cranica già scartato, sigillare la ferita chiudendo la pelle e applicando la colla chirurgica. Rimuovere l'animale dall'anestetico inalato e lasciarlo riprendersi su una superficie riscaldata.