Co-coltura di cellule di glioblastoma su neuroni modellati: una tecnica per monitorare la migrazione delle cellule di glioblastoma sui neuroni dell'ippocampo di ratto in vitro

Il glioblastoma possiede cellule staminali che migrano lungo i tratti assonali dei neuroni mielinizzati per invadere posizioni distanti nel cervello. Per ricapitolare la migrazione del glioblastoma o delle cellule GBM sui neuroni in vitro, iniziare prendendo un vetrino coprioggetti.

Attivare il vetrino coprioggetti mediante trattamento al plasma di ossigeno e innescarlo con un agente funzionalizzante. Questo trattamento favorisce un facile accesso alle sostanze chimiche nelle fasi successive. Aggiungere la soluzione PEGilata al vetrino coprioggetti e incubare. Questa soluzione ricopre il vetrino coprioggetti impedendo l'adesione dei neuroni in punti casuali.

Erogare un polimero fotoiniziatore sul vetrino coprioggetti e montarlo nella camera di imaging. Posizionare la camera sul tavolino di un microscopio a fluorescenza. Una volta all'interno, l'illuminazione UV attiva le molecole fotoiniziatrici localmente nelle aree designate corrispondenti ai micropattern previsti.

Le molecole fotoiniziatrici attivate fendono lo strato PEG sottostante, generando il modello desiderato. Ora, aggiungi la soluzione di laminina e incuba. La laminina - una glicoproteina - si deposita in punti specifici in cui lo strato di PEG è stato rimosso. Semina il terreno contenente i neuroni dell'ippocampo di ratto sul vetrino coprioggetti.

Incubare per consentire l'adesione dei neuroni sugli array rivestiti di laminina per ottenere vetrini coprioggetti con micropattern neuronale. Depositare una sospensione di cellule GBM marcate in fluorescenza sui neuroni micropatternizzati. Immagine per vedere le cellule fluorescenti GBM che migrano sui neuroni.

Per creare un substrato per la micropatternizzazione, trattare i vetrini circolari di vetro da 18 millimetri mediante attivazione ad aria o plasma per 5 minuti prima di posizionare i vetrini coprioggetti in un essiccatore con 100 microlitri di 3-aminopropil trietossisilano per 1 ora. Quindi, incubare una soluzione di Peg-SVA a 100 milligrammi per millilitro per 1 ora per la deposizione di gel. Al termine dell'incubazione, aggiungere 3 microlitri di PLPP e 50 microlitri di etanolo assoluto al centro del vetrino e attendere che si asciughi completamente.

Per la micromodellazione dei vetrini, montare il vetrino coprioggetti in una camera Ludin e posizionare la camera sul tavolino di un microscopio dotato di un sistema di messa a fuoco automatica. Dopo l'imaging, caricare le immagini con micropattern nel software. Dopo il sequenziamento automatico con illuminazione UV, utilizzare una pipetta per lavare accuratamente il PLPP dal vetrino coprioggetti con PBS. Quindi, incubare il vetrino coprioggetti con 50 microgrammi per millilitro di laminina per 30 minuti, seguito da un altro lavaggio con PBS come dimostrato.

Per allestire una coltura embrionale di neuroni ippocampali di ratto sui vetrini coprioggetto micromodellati, dopo l'ultimo lavaggio, reidratare i vetrini con terreno di coltura cellulare neuronale. Seminare 5 volte 10 al quarto neuroni ippocampali di ratto sospesi in terreno neurobasale arricchito con il 3% di siero di cavallo per centimetro quadrato su ciascun vetrino coprioggetti microstrutturato per un'incubazione di 24 ore in un incubatore al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Centrifugare le cellule di glioblastoma dissociato per 5 minuti a 1.000 giri/min e risospendere il pellet in un terreno di coltura cellulare di glioblastoma. Quindi, depositare 1 volte 10 nella terza cellula GBM sui neuroni microstrutturati.