Isolamento e coltura di periciti cerebrali primari: una procedura per isolare e coltivare periciti da capillari cerebrali bovini senza contaminazione delle cellule endoteliali

Nel sistema nervoso centrale, i periciti sono cellule multifunzionali che avvolgono le cellule endoteliali, che formano il rivestimento cellulare interno dei capillari. I periciti aiutano a regolare il flusso sanguigno e a mantenere l'omeostasi cerebrale.

Per isolare i periciti, iniziare prendendo i capillari del cervello bovino congelati in una fiala. Dopo lo scongelamento, trasferire il contenuto in un tubo contenente il supporto desiderato. Centrifugare per pellettare i capillari. Rimuovere il surnatante contenente il mezzo di congelamento. Risospendere il pellet capillare in un terreno e seminare la sospensione in un pallone rivestito di proteine a matrice extracellulare.

Incubare per consentire ai capillari di aderire al rivestimento nel pallone. Sostituire il terreno con un terreno contenente eparina. In coltura, il rivestimento proteico della matrice extracellulare promuove la migrazione dei periciti dai frammenti capillari e la proliferazione, mentre l'eparina stimola la migrazione delle cellule endoteliali.

Sostituire il terreno esaurito con un terreno contenente eparina. Nel tempo, i periciti proiettano processi allungati che aderiscono fortemente al pallone. Con uno spazio limitato nel substrato, le cellule endoteliali proliferano e formano un monostrato inibito dal contatto. Una volta raggiunta la densità dei periciti appropriata, rimuovere il terreno e lavare il pallone con tampone.

Utilizzare la tripsina-EDTA per staccare le cellule endoteliali debolmente legate dal pallone. Successivamente, aggiungere terreni per neutralizzare l'attività della tripsina-EDTA. Lavare ripetutamente con il terreno per rimuovere le cellule endoteliali staccate. Aggiungere il terreno e assicurarsi che i periciti rimangano attaccati al pallone. Incubare la coltura arricchita di periciti per proliferare.

Inizia scongelando una fiala di capillari in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Una volta scongelati i capillari, trasferirli in una provetta da centrifuga con 30 millilitri di DMEM-comp e centrifugarli per 5 minuti a 500 x g. Quindi, rimuovere il terreno dalla provetta e risospendere il pellet in 10 millilitri di DMEM-comp fresco. Trasferire la sospensione in un pallone T75 rivestito e lasciare che i capillari aderiscano al fondo per 4-6 ore in un'incubatrice a 37 gradi Celsius alimentata con il 10% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione, ispezionare il matraccio al microscopio ottico.

Le frazioni di capillari dovrebbero ora essere attaccate al fondo del pallone. Il giorno 4, dopo aver seminato i capillari, ispezionarli al microscopio per assicurarsi che siano confluenti all'incirca dal 60% al 70%. Aspirare il terreno e lavare delicatamente le cellule con PBS. Aggiungere 2 millilitri di tripsina-EDTA scongelata e lasciare il pallone nell'incubatrice per 1-3 minuti, estraendo frequentemente il pallone e osservando il distacco delle cellule con il microscopio. Quando le cellule endoteliali iniziano ad arrotondarsi, picchiettare delicatamente il pallone per staccarle.

Quando le cellule si sono staccate, interrompere la tripsinizzazione aggiungendo 10 millilitri di DMEM-comp al pallone. Sciacquare il matraccio alcune volte con il terreno e aspirare la sospensione di cellule endoteliali, che ora può essere utilizzata per altri scopi. Aggiungere 10 millilitri di DMEM-comp al pallone e controllarlo al microscopio ottico per assicurarsi che i periciti siano ancora presenti e attaccati al fondo. Quindi, rimettere il pallone nell'incubatore per consentire la crescita della coltura arricchita di periciti.