Isolamento dei capillari cerebrali dal cervello umano: un metodo ottimizzato per estrarre i capillari cerebrali dal tessuto cerebrale umano

I capillari cerebrali sono un componente vitale della barriera emato-encefalica, una barriera semipermeabile che consente il movimento selettivo dei soluti tra il sangue e il cervello. Per isolare i capillari cerebrali, iniziare con tessuto cerebrale umano fresco. Eliminate le meningi e tagliate via la sostanza bianca.

Tritare il tessuto cerebrale in frammenti più piccoli. Trasferire i frammenti in un omogeneizzatore contenente un tampone adatto e omogeneizzare. L'omogeneizzazione disintegra i tessuti, rilasciando capillari e detriti tissutali nella soluzione.

Trasferire l'omogeneizzato in una provetta nuova e aggiungere un volume ottimale di un mezzo di gradiente di densità adeguato. Centrifugare la soluzione per pellettare i capillari. Un mezzo di gradiente di densità troppo o troppo basso si traduce in una bassa resa capillare. Rimuovere il surnatante.

Risospendere il pellet in albumina sierica bovina o tampone integrato con BSA. La BSA stabilizza gli enzimi digestivi e mantiene l'integrità strutturale dei capillari. Quindi, filtrare la soluzione con un filtro appropriato per rimuovere i vasi di grandi dimensioni e i detriti di tessuto.

Quindi, passare il filtrato attraverso un filtro a maglie più piccole. Questo filtro trattiene i capillari cerebrali e consente il passaggio di detriti più piccoli e globuli rossi. Successivamente, capovolgere il filtro e lavare via i capillari in un tubo nuovo con tampone integrato con BSA.

Centrifugare la soluzione e rimuovere il surnatante. Risospendere i capillari puri in tampone e conservarli per un ulteriore utilizzo.

Per iniziare questa procedura documentare il peso del tessuto cerebrale umano, che dovrebbe essere di circa 10 grammi. Al microscopio, rimuovere con cura tutte le meningi con una pinza e utilizzare un bisturi per tagliare la sostanza bianca. Quindi, tagliare con cura il tessuto cerebrale e tritarlo con un bisturi per circa 5 minuti.

Trasferire il tessuto cerebrale nel tritatessuto e aggiungere 30 millilitri di tampone di isolamento. Successivamente, omogeneizzare ogni campione con 100 corse a 50 giri/min. Non mescolare l'aria per evitare bolle. Documentare il tempo ogni 25 bracciate e il tempo totale necessario per 100 bracciate. Successivamente, trasferisci l'omogeneizzato in un omogeneizzatore Dounce con ghiaccio. Omogeneizzare la sospensione per circa 20 colpi ed evitare bolle.

Quindi, distribuire equamente l'omogeneizzato cerebrale in quattro provette da centrifugazione da 50 millilitri e documentare il volume totale dell'omogeneizzato. Assicurarsi di aggiungere il volume corretto di Ficoll. Troppo poco o troppo Ficoll si tradurrà in una densità errata per separare i capillari dai detriti cellulari e quindi ridurrà il pellet capillare e limiterà la resa.

Utilizzare 10 millilitri di tampone isolante per sciacquare il pestello e l'omogeneizzatore e distribuirlo nelle quattro provette di centrifugazione. Quindi, distribuire 50 millilitri di tampone a gradiente di densità nelle provette di centrifugazione. Chiudere ermeticamente le provette da centrifuga con i tappi. Successivamente, mescolare l'omogeneizzato, il mezzo del gradiente di densità e il tampone agitando energicamente le provette. Centrifugare a 5.800 x g per 15 minuti a 4 gradi Celsius. Successivamente, scartare il surnatante e risospendere ogni pellet in 2 millilitri di BSA all'1%.

Dopo aver risospeso il pellet, filtrare la sospensione attraverso la maglia da 300 micrometri. I capillari vengono filtrati attraverso la rete, mentre i vasi più grandi e i detriti cerebrali più grandi rimangono sulla rete. Lavare accuratamente la rete con un massimo di 50 millilitri di BSA all'1%, quindi scartare la rete. Per separare i capillari dai globuli rossi e da altri detriti cerebrali, distribuire il filtrato capillare su filtri di deformazione cellulare da 530 micrometri.

I capillari sono trattenuti da questo filtro, mentre i globuli rossi, altre singole cellule e piccoli detriti cerebrali passano attraverso il filtro e vengono raccolti nel filtrato. Successivamente, lavare ogni filtro con 25 millilitri di BSA all'1%. Versare tutti i filtrati sul sesto filtro per aumentare la resa. Lavare ogni filtro con 50 millilitri di 1% BSA. Conservare i filtri di deformazione cellulare contenenti i capillari e scartare il filtrato. Quindi, capovolgere i filtri e lavare i capillari con 50 millilitri di BSA all'1% in provette da 50 millilitri.

Applicare delicatamente una pressione con la punta della pipetta e spostarla sul filtro per lavare via i capillari cerebrali. Assicurati di lavare via tutti i capillari cerebrali, in particolare dal bordo del filtro. Evitare le bolle poiché ciò rende più difficile il processo di filtrazione e aumenta la possibilità di perdita capillare. Dopo aver raccolto i capillari, centrifugare tutti i campioni a 1.500 x g per 3 minuti a 4 gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in circa 3 millilitri di tampone di isolamento.

Quindi, combinare tutti i pellet risospesi da un campione in una provetta conica da 15 millilitri e riempirla con un tampone di isolamento. Centrifugare nuovamente a 1.500 x g per 3 minuti a 4 gradi Celsius e lavare altre due volte. Documenta la purezza dei capillari con un microscopio a ingrandimento 100X e una fotocamera. I capillari cerebrali isolati possono ora essere utilizzati per esperimenti, elaborati o congelati e conservati a meno 80 gradi Celsius in criotubi per un minimo di 6-12 mesi.