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0 visualizzazioni • 5:19 min • July 8th, 2025
Inizia prendendo un modello di topo femmina anestetizzata incinta posta in posizione supina. Prepara il topo rimuovendo i peli dalla regione addominale. Incidere la pelle e gli strati muscolari sottostanti per esporre le corna uterine, i siti che ospitano gli embrioni vitali.
Ora, estrai le corna uterine dalla cavità addominale. Prendi un capillare di vetro a punta affilata contenente la soluzione di DNA plasmidico desiderata. Localizzare il cervello dell'embrione e iniettare la soluzione di DNA plasmidico attraverso la parete dell'utero nel quarto ventricolo. Questa posizione è anteriore al primordio cerebellare, la posizione desiderata per l'eventuale consegna del DNA.
Dopo l'iniezione, ritrarre il capillare vuoto. Successivamente, per l'elettroporazione dell'embrione iniettato nel DNA, posizionare i due elettrodi sulla parete uterina in modo tale che l'elettrodo positivo copra il primordio cerebellare e l'elettrodo negativo copra la regione intorno alle orecchie.
Applicare impulsi elettrici per la durata desiderata. Questi impulsi rendono permeabili le cellule neuronali cerebellari, consentendo al DNA plasmidico di entrare nelle cellule bersaglio. Infine, riposiziona le corna uterine all'interno della cavità addominale nella loro posizione naturale. Sutura i tagli, trasferisci il topo nella sua gabbia e lascialo riprendere.
Inizia caricando un capillare di vetro borosilicato in un estrattore per micropipette e tirando per creare una punta fine. Etichettare la punta capillare con inchiostro nero per una migliore visualizzazione durante l'iniezione e disegnare una scala sul vetro. Lavorando sotto uno stereomicroscopio, usa un righello e una pinzetta ad ago affilata per tagliare la punta a una lunghezza di circa 6 millimetri e creare un bordo smussato affilato e unilaterale.
Filtrare una soluzione madre Fast Green all'1% attraverso un filtro da 0,22 micron per rimuovere le particelle di colorante dalla soluzione. Mescolare i plasmidi di RNA a guida singola in parti uguali con il plasmide reporter luciferasi fino a una concentrazione finale di almeno 1 microgrammo per millilitro per ciascun plasmide.
Colorare la soluzione di plasma con Fast Green a una concentrazione finale dello 0,05%. Dopo aver anestetizzato un topo CD-1 gravido con isoflurano, posizionare il topo sulla schiena su un termoforo e somministrare un analgesico. Applicare un unguento per gli occhi per prevenire la secchezza oculare durante l'intervento chirurgico. Fissare gli arti con del nastro adesivo e sterilizzare l'addome con un disinfettante.
Coprire il topo con una garza, lasciando esposta solo l'area chirurgica. Dopo aver praticato un'incisione cutanea di circa 2 centimetri di lunghezza, individuare la linea alba e utilizzare le forbici per tessuti a punta smussata per praticare una seconda incisione leggermente più piccola attraverso il peritoneo. Inumidire la cavità addominale aperta con PBS sterile preriscaldato.
Quindi, usa una pinza ad anello per estrarre con cura le corna uterine dalla cavità addominale. Afferrare la parete uterina nello spazio tra le sacche vitellino di due embrioni vicini e tirare delicatamente. Evitare qualsiasi pressione sull'embrione mentre lo si tira attraverso l'incisione. Una volta estratte le corna uterine, aspirare circa 10-15 microlitri di soluzione plasmidica colorata con il capillare di vetro preparato. Evitare bolle d'aria durante questo processo.
Tenere delicatamente l'embrione con una pinza ad anello e individuare la zona del collo. Penetra lentamente nel rombencefalo dorsale con la punta del capillare di vetro e spostati nel quarto ventricolo. Iniettare circa 1 microlitro della miscela plasmidica. Conferma che il DNA colorato non è fuoriuscito dal cervello ed è visibile come una struttura a forma di diamante.
Qui, è molto importante riempire l'intera regione del quarto ventricolo con una soluzione plasmidica per fornire il DNA anche alla parte distale del primordio cerebellare. Allo stesso tempo, assicurati di non causare sanguinamento durante questo processo.
Posizionare lateralmente una pinzetta di platino dotata di piastre elettrodiche di 5 millimetri di diametro sopra la testa dell'embrione con il polo negativo che copre l'orecchio e il polo positivo posizionato in corrispondenza del primordio cerebellare sopra la parete uterina e applicare impulsi elettrici quadrati.
Quando tutti gli embrioni sono stati elettroporizzati, riposizionare con cura le corna uterine nella cavità addominale e riempirle con PBS sterile. Lascia che il corno uterino scivoli in una posizione naturale. Disattiva l'anestesia e metti l'animale a pancia in giù in una nuova gabbia per riprendersi.