Saggio di fagocitosi in vitro: un metodo basato sull'imaging dal vivo per studiare la fagocitosi sinaptosomica mediata da astrociti in tempo reale

I sinaptosomi sono frazioni neuronali isolate ricche di vescicole sinaptiche. Questi sinaptosomi sono inghiottiti dagli astrociti, una popolazione di cellule immunitarie nel cervello, attraverso un processo noto come fagocitosi.

Per studiare la fagocitosi in vitro mediata da astrociti, iniziare prendendo una piastra di coltura contenente un monostrato di astrociti. Ora, aggiungere alla piastra la sospensione di sinaptosoma coniugato con indicatore di pH. Questo colorante indicatore ha la proprietà di emettere fluorescenza esclusivamente a basso pH. Incubare la piastra per la durata desiderata.

Durante l'incubazione, la fosfatidilserina o PS presente sulla membrana esterna del sinaptosoma gli permette di legarsi ai corrispondenti recettori PS sulla membrana degli astrociti. Questo facilita l'insediamento dei sinaptosomi alla base. Aspirare il terreno esaurito insieme ai sinaptosomi non legati dalla piastra.

Successivamente, integrare la piastra con fattori che promuovono la fagocitosi e incubare. Successivamente, visualizzare la lastra utilizzando un microscopio a fluorescenza. Dopo essersi legati alla superficie, gli astrociti inghiottono i sinaptosomi facendoli entrare nei fagosomi. Una volta all'interno dei fagosomi, il basso pH fa sì che le molecole del colorante indicatore emettano una fluorescenza brillante.

L'imaging in tempo reale rivela la presenza di macchie fluorescenti luminose corrispondenti ai sinaptosomi coniugati dell'indicatore di pH inghiottiti dagli astrociti. Alla fine, queste macchie scompaiono, indicando una degradazione riuscita dei sinaptosomi.

Per l'imaging dal vivo dell'inghiottimento del sinaptosoma, in primo luogo, rimuovere il surnatante da ciascun pozzetto di una coltura di astrociti confluenti e lavare rapidamente le cellule tre volte con 1 millilitro di DPBS per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 300 microlitri di terreno basico per astrociti immunopannati e 5 microlitri di sinaptosomi coniugati con indicatore di pH, oltre a eventuali fattori aggiuntivi che possono modulare la fagocitosi delle cellule gliali.

Lasciare che i sinaptosomi si depositino sul fondo dei pozzetti e si attacchino ai recettori della fosfatidilserina sugli astrociti a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Dopo 40 minuti, scartare i surnatanti e lavare rapidamente ma delicatamente i pozzetti tre volte con 1 millilitro di DPBS per lavaggio.

Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 500 microlitri di terreno fresco integrato con i fattori di interesse ai pozzetti appropriati e trasferire la piastra in uno strumento di imaging dal vivo. Selezionare le posizioni dell'imaging, regolare la messa a fuoco, il tempo di esposizione, la luminosità e la potenza del LED e impostare il formato dell'immagine, l'intervallo di tempo e il numero totale di cicli per l'imaging dal vivo come appropriato sperimentalmente. Quindi, inizia l'imaging dal vivo degli esperimenti di fagocitosi.