Dissezione del cervelletto e preparazione delle fette: un metodo per generare fette di tessuto dal cervelletto di topo

Nei topi, il cervelletto è situato alla base del proencefalo ed è costituito da due emisferi laterali uniti da una linea mediana - verme. Il cervelletto, che contiene la maggior parte dei neuroni del cervello, è vitale per gli studi neurologici.

Per generare fette di cervelletto, inizia con una testa di topo decapitata. Inserisci le forbici nel forame magno, l'apertura alla base del cranio. Incidere delicatamente il teschio e rimuoverlo. Quindi, estrai il cervello e taglia i nervi ottico e trigemino. Rilasciare il cervello in un mezzo di dissezione raffreddato con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Separa il rombencefalo dalle altre parti del cervello.

Quindi, taglia i peduncoli cerebellari sottostanti - la connessione tra il cervelletto e il tronco encefalico - per staccare il cervelletto. Rimuovere le meningi dal cervelletto. Posizionare con cautela il cervelletto su una piattaforma di trinciatura perpendicolare alla lama del tritatutto. Ora, sezionare le fette di tessuto di spessore appropriato. Immediatamente, bagnare le fette e trasferirle nuovamente nella capsula di Petri contenente il mezzo di dissezione.

Separare e identificare le fette dal verme. Trasferire le fette selezionate in un pozzetto inserito in una piastra di coltura contenente un terreno di coltura adatto. Incubare la coltura per mantenere l'integrità strutturale e funzionale delle fette cerebellari sezionate per ulteriori esperimenti.

Per iniziare, inserisci delicatamente una piccola forbice nel forame magno e taglia il cranio praticando un'incisione laterale verso il lato e poi taglia tutto intorno al cranio della testa. Per recuperare la parte dorsale del cranio, utilizzare una pinza dritta e sottile per sollevare con cautela la parte dorsale del cranio.

Quindi, introdurre con cautela il forcipe tra il cranio ventrale e il cervello. Estrarre delicatamente il cervello e tagliare i nervi ottico e trigemino con piccole forbici. Quindi, capovolgi la testa o la parte dorsale del cranio appena sopra un piatto di coltura cellulare da 60 millimetri contenente un terreno di dissezione ghiacciato per aiutare il cervello a cadere per gravità.

Usando una pinza fine, orientare il cervello con il lato dorsale rivolto verso l'alto e il lato ventrale sdraiato. Sotto il microscopio binoculare, usa la pinza dritta sottile per immobilizzare il cervello sul lato del proencefalo. Quindi, separa il rombencefalo dal resto del cervello. Taglia i peduncoli cerebellari sotto il cervelletto per separare il cervelletto dal resto del rombencefalo.

Una volta isolato il cervelletto, usa una pinza dritta per strappare via con cura le meningi. Tenere delicatamente il cervelletto con la pinza curva sottile e posizionarlo con il lato dorsale rivolto verso l'alto sulla piattaforma di plastica perpendicolare alla lama del rasoio del tritatutto. Quindi, con una punta di pipetta sterile con estremità sottile collegata a una pipetta da 1 millilitro, aspirare l'eccesso di terreno di dissezione intorno al cervelletto. Quindi, con un tritafazzoletti ho affettato sezioni sagittali spesse 300 micrometri del cervelletto.

Quindi, aggiungere delicatamente una goccia di terreno di dissezione sul cervelletto affettato. Quindi, con una punta della pipetta a foro largo attaccata alla pipetta da 1 millilitro, aspirare lentamente il cervelletto affettato e trasferirlo nuovamente nel piatto di coltura cellulare da 60 millimetri contenente un terreno di dissezione ghiacciato.

Quindi, usa due pinze dritte sottili per separare le singole fette. Quindi, con un puntale di pipetta a foro largo attaccato alla pipetta da 1 millilitro, trasferire fino a quattro fette selezionate dal verme insieme a un po' di terreno di dissezione su un inserto di coltura di una piastra a 6 pozzetti. Rimuovere l'eccesso di terreno di dissezione intorno alle fette utilizzando un puntale per pipetta con estremità sottile.