JoVE Encyclopedia of Experiments
Ricerca sul cancro
0 visualizzazioni • 5:43 min • July 8th, 2025
Iniziare l'elettroporazione prelevando una pipetta di vetro contenente la soluzione plasmidica desiderata. Fissarlo a un supporto per micropipette dotato di un elettrodo a filo d'argento, assicurandosi che l'elettrodo sia inserito nella micropipetta. Prendi una camera di elettroporazione contenente una sezione ippocampale ultrasottile immersa nel liquido cerebrospinale artificiale.
Immergere l'elettrodo di terra nel fluido presente nella camera per la successiva elettroporazione. Abbassare il puntale della pipetta nella camera di elettroporazione e registrare la resistenza di base. Utilizzare un microscopio per posizionare la punta della pipetta vicino alla cellula target. Una volta che la pipetta è a contatto con la membrana neuronale, la sua resistenza aumenta notevolmente.
Applicare una pressione positiva dell'aria per creare una piccola invaginazione nella membrana neuronale. Applicare rapidamente una leggera aspirazione per spingere la membrana verso l'alto, creando una tenuta allentata tra il puntale della pipetta e la membrana. Ripetere questo processo ancora un paio di volte per condizionare la membrana ed evitare la lisi cellulare.
Dopo il condizionamento, applicare una forte aspirazione per formare una tenuta ermetica con una membrana chiamata guarnizione gigaohm. Utilizzare impulsi elettrici per formare pori transitori nell'area sigillata della membrana. Queste aperture facilitano l'ingresso dei plasmidi all'interno del neurone bersaglio. Dopo l'elettroporazione, i pori si richiudono, intrappolando i plasmidi all'interno del neurone.
Per preparare le colture a fette per l'elettroporazione, trasferire gli inserti di coltura di interesse in singole piastre di Petri da 3 centimetri caricate con 900 microlitri di terreno di coltura e posizionare le colture in un incubatore ad anidride carbonica da tavolo. Successivamente, pre-incubare gli inserti di coltura freschi con 1 millilitro di terreno di coltura a fette per inserto in una piastra di Petri da 3,5 centimetri per almeno 30 minuti e sterilizzare le linee del rig di elettroporazione con candeggina al 10% per 5 minuti.
Al termine della perfusione, sciacquare le linee con l'acqua ionizzata autoclavata per almeno 30 minuti prima di perfondere con aCSF sterilizzato con filtro contenente 0,001 millimolari di tetrodotossina. Impostare l'impulso dell'elettroporatore su un'ampiezza di meno 5 volt, un impulso quadrato, un treno di 500 millisecondi, una frequenza di 50 Hertz e un'ampiezza dell'impulso di 500 microsecondi. Riempi una pipetta di vetro con 5 microlitri di soluzione interna contenente plasmidi e picchietta delicatamente e picchietta più volte la punta per rimuovere eventuali bolle intrappolate.
Utilizzare un microscopio da dissezione per verificare che la punta non sia danneggiata e fissare saldamente la punta della pipetta all'elettrodo. Quando il puntale entra in contatto con l'aCSF, registrare la lettura della resistenza della pipetta dell'elettroporizzatore. Per isolare una coltura a fette, tagliare la membrana dell'inserto di coltura con una lama affilata e utilizzare una pinza ad angolo acuto per trasferire con cura la coltura a fette nella camera di elettroporazione. Quindi, fissare la posizione delle impostazioni cultura con un ancoraggio di sezione.
Per l'elettroporazione delle cellule di interesse, applicare una pressione positiva alla pipetta per bocca e utilizzare i comandi tridimensionali della manopola per manovrare la punta della pipetta vicino alla superficie della coltura della fetta. Osservando la coltura con il microscopio, avvicinarsi alla cellula bersaglio con la punta, mantenendo la pressione positiva applicata fino a quando non si forma una fossetta sulla superficie cellulare. Dopo la visualizzazione della fossetta, applicare rapidamente una leggera pressione negativa con la bocca in modo che si formi una tenuta allentata tra la punta della pipetta e la membrana plasmatica.
La membrana entrerà leggermente nella pipetta. Si deve osservare un aumento di circa 2,5 volte della resistenza iniziale della pipetta, come indicato da un aumento del tono dagli altoparlanti. Riapplicare rapidamente la pressione positiva in modo che la fossetta si riformi. Quindi, completare immediatamente almeno altri due cicli di pressione come appena dimostrato senza pause. Dopo l'ultimo impulso di pressione, mantenere la pressione negativa per 1 secondo. Il tono degli altoparlanti raggiunge un apice stabile dell'intonazione. Utilizzare il pedale per pulsare rapidamente l'elettroporatore.
Dopo l'elettroporazione, ritrarre delicatamente la pipetta a circa 100 micron dalla cella senza applicare pressione e riapplicare la pressione positiva, verificando che la resistenza sia simile alla lettura della linea di base prima di avvicinarsi alla cella successiva. Quando tutte le cellule di interesse sono state elettroporizzate, trasferire la coltura a fette in uno degli inserti di coltura freschi preparati e posizionare l'inserto a 35 gradi Celsius per un massimo di 3 giorni.