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[INSERIRE FIGURE1 QUI]
Figura 1: Colonna vertebrale sezionata e midollo spinale rilasciato da un topo neonatale di 3 giorni. La freccia in (a) punta verso l'estremità caudale della colonna vertebrale, dove viene inserito un ago per rilasciare il midollo spinale. Un midollo spinale rilasciato (b) viene mostrato immerso nel PBS.
[INSERIRE FIGURE2 QUI]
Figura 2: Gradiente di densità, con l'aggiunta di cellule dopo la centrifu
Per isolare i neuroni del midollo spinale, prendere una colonna vertebrale di un topo neonatale e posizionarla su una capsula di Petri. Lavare la colonna vertebrale con un tampone salino per rilasciare il midollo spinale. Trasferire il midollo spinale in un mezzo neuronale freddo per promuovere la sopravvivenza cellulare.
Quindi, tritare il midollo spinale e trasferire i frammenti in un tubo contenente terreno neuronale fresco. Incubare la provetta in un bagnomaria shaker per l'acclimatazione. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno esaurito e aggiungere il terreno di digestione. Gli enzimi digestivi scindono la matrice tissutale per sciogliere le cellule.
Eseguire la triturazione aspirando i frammenti di tessuto nella pipetta e svuotare rapidamente i componenti, rilasciando le singole cellule in sospensione. Quindi, trasferire questa sospensione in una provetta contenente un mezzo di gradiente di densità e centrifugare.
Dopo la centrifugazione, lo strato superficiale della provetta contiene detriti di tessuto. Il primo strato comprende oligodendrociti e astrociti. Il secondo e il terzo strato comprendono i neuroni, con il terzo strato che ha la purezza più elevata. Infine, il pellet contiene cellule microgliali.
Raccogliere il terzo strato in una provetta nuova e aggiungere il terreno neuronale per diluire il mezzo del gradiente di densità. Centrifuga per pellettizzare i neuroni. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in un mezzo neurobasale per preservare i neuroni per ulteriori esperimenti.
Per iniziare questa procedura, separare la testa dal corpo dei cuccioli di topo soppressi usando le forbici. Quindi, stabilizzare la coda e le braccia sul tavolo operatorio con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Quindi, taglia la pelle usando le forbici dell'iride curve. Successivamente, taglia il midollo spinale dalla regione lombare appena sopra i fianchi e poi taglia entrambi i lati del torace per separarlo dal corpo.
Lavare i campioni in sequenza in tre piastre di Petri da 10 centimetri contenenti 5 millilitri di PBS sterilizzato per 10 secondi ciascuna per rimuovere il tessuto in eccesso. Successivamente, inserire un ago calibro 22 e una siringa riempita con 5 millilitri di PBS sterilizzato nell'estremità caudale della colonna vertebrale e sciacquare cranialmente, consentendo al cordone di uscire in una quarta capsula di Petri.
Trasferire il midollo spinale in una provetta da 15 millilitri con 5 millilitri di HABG su ghiaccio. Evita di schiacciare il midollo spinale e ripeti le procedure per il resto dei cuccioli. Idealmente, questo processo non dovrebbe richiedere più di 30 minuti per un gruppo di cuccioli per garantire un sano isolamento dei neuroni.
Per preparare il gradiente di densità, preparare ciascuno dei quattro strati in quattro provette da 15 millilitri. Quindi, aggiungi 1 millilitro di ogni strato in un nuovo tubo da 15 millilitri. Iniziare con lo strato 1 in basso e aggiungere in sequenza fino a raggiungere lo strato 4 in alto. Evitare di disturbare gli strati durante l'aggiunta e qualsiasi movimento vigoroso che possa causare la miscelazione. Quindi, aggiungi il mezzo di digestione al tessuto tritato. Posizionare il campione in un agitatore a bagnomaria a 30 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere il fazzoletto dal bagnomaria e lasciarlo riposare per alcuni minuti.
Per eseguire la triturazione, aspirare il mezzo di digestione in eccesso. Sospendere il tessuto in 2 millilitri di HABG. Utilizzando una pipetta a foro stretto, triturare 10 volte in 45 secondi ed evitare di introdurre aria in quanto ridurrà significativamente la resa vitale. La triturazione è una delle fasi più critiche della procedura. Il tessuto deve essere accuratamente aspirato e svuotato dalla pipetta lucidata a fuoco, evitando un vigore eccessivo, che può portare alla morte neuronale, o di essere troppo delicato, che si tradurrà in una bassa resa.
Successivamente, aspirare i 2 millilitri superiori del surnatante e trasferirli in un nuovo tubo da 15 millilitri etichettato come "collezione". Ripetere le procedure di raccolta altre due volte per ottenere 6 millilitri di surnatante. Successivamente, trasferire lentamente il contenuto della provetta di raccolta nella provetta a gradiente preparata in precedenza, evitando l'interruzione del gradiente.
Per purificare i neuroni, centrifugare la provetta a gradiente per 15 minuti a 800 x g e 22 gradi Celsius. Raccogli gli strati desiderati e trasferiscili in un nuovo tubo da 15 millilitri. Per ottenere il massimo isolamento dei neuroni di purezza, raccogliere lo strato 3. Per una maggiore resa con meno purezza, raccogli gli strati da 2 a 3.
Successivamente, diluire il gradiente di densità aggiungendo 5 millilitri di HABG agli strati appena raccolti. Centrifugare a 200 x g per 2 minuti a 22 gradi Celsius. Dopo 2 minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 5 millilitri di HABG azionando il pellet. Successivamente, centrifugare nuovamente il campione a 200 x g per 2 minuti a 22 gradi Celsius. Quindi, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 3 millilitri di terreno neurobasale azionando il pellet.