JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 visualizzazioni • 3:38 min • July 8th, 2025
La superficie dorsale della lingua di topo è ricoperta da tre tipi principali di sporgenze rialzate chiamate papille, vale a dire papille fungiformi, circumvallate e filiformi. Le papille circumvallate, o CVP, che comprendono trincee epiteliali che ospitano le papille gustative, sono sostenute da uno strato di tessuto connettivo, la lamina propria.
Per isolare l'epitelio CVP, iniziare con un topo soppresso in posizione supina. Quindi, incidere le guance e sezionare la spessa fascia di tessuto - il frenulo linguale - per separare la lingua dal pavimento della cavità orale. Trasferire la lingua asportata in una pirofila contenente tampone freddo.
Quindi, ritaglia la parte anteriore della lingua. Iniettare con cautela un cocktail digestivo contenente enzimi dispasi e collagenasi nello spazio subepiteliale della regione CVP, tra l'epitelio e i tessuti sottostanti. Ritrarre l'ago mentre si inietta la sospensione nella regione.
Incubare la lingua per la durata appropriata. Le dispasi e le collagenasi digeriscono le proteine della matrice extracellulare all'interno del tessuto connettivo, facilitando la separazione dell'epitelio CVP dal tessuto. Dopo l'incubazione, praticare delle incisioni nell'epitelio nella regione CVP.
Separare delicatamente l'epitelio allentato dal tessuto sottostante. Infine, trasferire l'epitelio CVP separato in una provetta rivestita di proteine per evitare che il tessuto si attacchi alla parete della provetta. L'epitelio CVP può essere conservato per un'ulteriore elaborazione a valle.
Dopo l'eutanasia di un topo adulto, usa grandi forbici da dissezione sterili per tagliare le guance e rompere la mascella. Quindi, sollevare la lingua e tagliare il frenulo linguale per separare la lingua dal pavimento della cavità orale. Tagliare la lingua e raccoglierla in dPBS sterile ghiacciato con calcio e magnesio.
Al microscopio da dissezione, rimuovere e scartare la lingua anteriore tagliando appena davanti all'eminenza intermolare con una lama di rasoio. Quindi, utilizzando una salvietta delicata per rimuovere i peli e il liquido in eccesso dalla lingua posteriore.
Successivamente, riempire una siringa da 1 millilitro con 200-300 microlitri di soluzione enzimatica per iniezione e inserire un ago da 30 gauge, 1/2 pollice appena sopra l'eminenza intermolare fino all'interno delle papille circumvallate o CVP. Iniettare la soluzione enzimatica sotto e ai bordi laterali del CVP tra l'epitelio e i tessuti sottostanti. Estrarre la siringa lentamente e continuamente dalla lingua durante l'iniezione della soluzione.
Incubare la lingua in dPBS sterile privo di calcio/magnesio a temperatura ambiente per esattamente 33 minuti. Usando le forbici da dissezione extra fine, praticare piccoli tagli nell'epitelio bilateralmente e appena anteriormente al CVP. Quindi, sbucciare delicatamente l'epitelio sollevandolo con una pinza fine. Una volta che l'epitelio della trincea è libero dal tessuto connettivo sottostante, posizionarlo in una provetta da microcentrifuga da 2 millilitri pre-rivestita con FBS.