Iniezione di microbolle in embrioni di topo isolati: una tecnica per fornire agenti di contrasto a microbolle nel sistema vascolare di embrioni murini viventi

Per l'erogazione di microbolle, iniziare con una sospensione uniforme di microbolle a guscio lipidico mirate alle cellule endoteliali comprendenti un nucleo gassoso in una siringa collegata al tubo.

Caricare questo gruppo in una pompa a siringa e collegare un ago di vetro al tubo. Ora, trasferisci un embrione di topo refrigerato che esprime specifici recettori delle cellule endoteliali in un piatto posizionato sul palco di uno stereoscopio.

Esteriorizzare delicatamente l'embrione dal sacco vitellino e dalla membrana amniotica. Fissare la sacca e i bordi placentari. Sciacquare l'embrione con un tampone caldo per ripristinare il flusso sanguigno. Copri l'embrione con un gel per ultrasuoni preriscaldato per una trasmissione ottimale delle onde ultrasoniche. Integrare con tampone per mantenere le sue condizioni fisiologiche.

Iniettare con cautela la sospensione di microbolle alla velocità di flusso desiderata in una vena adatta sulla superficie della membrana fetale del disco placentare utilizzando la pompa a siringa. Le microbolle iniettate viaggiano attraverso la circolazione e si legano ai recettori specifici sulle cellule endoteliali che rivestono i vasi sanguigni.

Utilizzare un trasduttore a ultrasuoni per trasmettere onde ultrasoniche ad alta frequenza all'embrione. I nuclei di gas altamente comprimibili delle microbolle le fanno oscillare in modo non lineare, disperdendo le onde ultrasoniche con frequenze diverse dalle onde incidenti. Questi segnali e i segnali lineari del tessuto ritornano al trasduttore.

Il trasduttore li trasmette a un sistema di imaging che differenzia i segnali diffusi nelle microbolle dai segnali tissutali, producendo immagini ecografiche con contrasto dei vasi sanguigni embrionali.

Pipettare il volume necessario di soluzione madre di microbolle e aggiungerlo all'aliquota di soluzione fisiologica. Mescolare mescolando delicatamente con la punta della pipetta. Quindi, utilizzare un ago calibro 21 per aspirare la soluzione di microbolle diluita in una siringa pulita. Dopo aver rimosso l'ago, eliminare eventuali bolle d'aria dalla siringa e collegare il luer e il tubo. Spingere lentamente la soluzione fino all'estremità del tubo, facendo attenzione a non generare bolle d'aria.

Infine, inserire la siringa in una pompa per infusione a siringa impostata per erogare le microbolle a una velocità di 20 microlitri al minuto per un volume totale di 20 microlitri. Collegare un ago di vetro tirato all'estremità del tubo. Avvicinare la pompa allo stadio di iniezione. Usa un cucchiaio forato per selezionare e rimuovere casualmente un embrione dal piatto di supporto refrigerato. Posizionare l'embrione in una capsula di dissezione situata sul tavolino ad ultrasuoni sotto lo stereoscopio.

Quindi, individua il lato dell'embrione che appare meno vascolarizzato. Ecco un'area di bassa vascolarizzazione, generalmente adiacente alla regione della testa. Quindi, usa una pinza fine per tagliare o strappare quanto basta del sacco vitellino e delle membrane amniotiche per poter rimuovere l'embrione dall'interno, ma non di più. Quindi, manovra delicatamente la sacca intorno all'embrione. Quindi, posiziona l'embrione su un lato con la placenta e i vasi ombelicali davanti.

Stabilizzare la capsula di dissezione utilizzando piccoli pezzi di plastilina. Usando quattro spilli per insetti, fissa il sacco vitellino e i bordi della placenta, evitando vasi importanti. Utilizzando una siringa contenente PBS preriscaldato a 45 gradi Celsius, lavare l'embrione fino a quando non si vede il sangue fluire nell'embrione. L'arteria ombelicale è identificata dal sangue pulsante di colore rosso vivo. La vena ombelicale e la sua rete vascolare associata hanno sangue più scuro e di solito si sovrappongono a quelli dell'arteria ombelicale sul lato placentare.

A questo punto, posizionare la piastra in modo che l'iniezione possa essere eseguita comodamente. Una volta che l'embrione si è rianimato, coprilo, ma non la placenta, con un gel per ultrasuoni preriscaldato. Usa una pinza fine per rimuovere delicatamente eventuali bolle d'aria intorno all'embrione e riempi il piatto con PBS preriscaldato. Durante la procedura, tenere d'occhio il livello di soluzione nelle siringhe PBS e gel e aggiungere siringhe di riserva al becher riscaldante, se necessario.

Quindi, montare l'ago di vetro su una grande palla di plastilina sul bordo del piatto di dissezione e inserire l'estremità dell'ago nel PBS. Scegli una vena sulla superficie corionica del disco placentare il più lontano possibile dal ramo principale. Quindi, usa le forbici per tagliare la punta dell'ago in modo che corrisponda alle dimensioni del vaso, tagliando la punta con una leggera angolazione. Usa il bordo delle forbici a molla per rimuovere eventuali bordi frastagliati del vetro.

Ora, usando la pompa a siringa, iniettare lentamente la soluzione di microbolle a 20 microlitri al minuto nell'ago di vetro fino a quando tutta l'aria viene espulsa dalla punta dell'ago e le microbolle possono fluire liberamente nel PBS. Arrestare la pompa e reimpostarla per un volume di iniezione di 20 microlitri. Non permettere all'aria di entrare nell'ago per iniezione in modo da evitare di iniettare aria nel sistema vascolare dell'embrione.

Inserire delicatamente la punta dell'ago di vetro nella vena selezionata nella placenta e assicurarsi che sia immobile. Allontanare la testa dello stereoscopio e posizionare il trasduttore a ultrasuoni in modo che l'embrione si trovi uniformemente tra i focolai a 6 e 10 millimetri. Successivamente, avviare l'imaging e avviare l'iniezione in bolo delle microbolle. Dopo un minuto, al termine dell'iniezione, avviare il timer per la fase di acquisizione dei dati.