Isolamento dei batteri commensali congiuntivali basato su tampone: una tecnica per isolare i batteri commensali dalla congiuntiva del modello murino

La congiuntiva dell'occhio ospita i batteri commensali. Questa microflora indigena protegge l'occhio dalle infezioni attivando le cellule immunitarie per attaccare eventuali microbi dannosi che entrano nelle pareti oculari.

Per isolare i batteri commensali, posizionare un topo anestetizzato in posizione laterale. Prelevare un tampone oculare sterile imbevuto di un terreno adatto. Inserire la punta del tampone bagnata nella regione congiuntivale mediale dell'occhio sinistro. Premere il bulbo oculare e muovere il tampone avanti e indietro lungo la congiuntiva per raccogliere una popolazione commensale diversificata.

Rimuovere il tampone e mescolarlo in una provetta contenente terreni di arricchimento microbico. Questo passaggio rilascia i batteri intrappolati dalla rete di cotone del tampone nel terreno. Scartare il tampone e incubare la provetta per facilitare l'insorgenza della crescita batterica.

Erogare alcune gocce del terreno arricchito inoculato con tampone oculare su una piastra di agar sanguigno secondo lo schema desiderato e incubare. La caseina e i peptoni di soia presenti nel terreno forniscono l'azoto necessario per la sintesi dei peptidi, mentre il cloruro di sodio mantiene l'equilibrio osmotico.

I batteri commensali possiedono enzimi emolisina che digeriscono l'emoglobina presente nei mezzi sanguigni. Questo produce un modello caratteristico sulla piastra di agar, causando la proliferazione di diversi batteri in colonie morfologicamente distinte. Conta il numero di colonie per determinare la loro abbondanza relativa nella congiuntiva.

Assicurarsi che il mouse sia adeguatamente anestetizzato premendo un cuscinetto del piede posteriore. Procedere solo se non c'è movimento. Assegna una mano per maneggiare i topi anestetizzati e l'altra mano per maneggiare il tampone oculare e la coltura. Rimuovi il mouse dalla gabbia e posizionalo sopra il piano di lavoro posizionato su un lato con l'occhio sinistro esposto. Spruzzare le mani guantate con isopropanolo e asciugarle con un tovagliolo di carta.

Stappare una provetta per microcentrifuga BHI etichettata con la mano dedicata per la manipolazione dei terreni e riposizionare la provetta nel rack. Immergere la punta rivestita di cotone del tampone oculare nel BHI. Quindi, estrarre il tampone dalla provetta facendo roteare due volte la punta contro la camera d'aria per rimuovere il liquido in eccesso e rimuoverlo.

Con la mano che maneggia il mouse, tieni delicatamente il mouse per la collottola. Con l'altra mano, posizionare la punta del tampone oculare contro la regione congiuntivale mediale dell'occhio sinistro. Premere leggermente il bulbo oculare e muovere il tampone con un movimento di lavaggio della finestra tra la palpebra inferiore e l'occhio 10 volte, mantenendo una pressione costante. Senza toccare il pelo, rimuovere delicatamente la punta del tampone perpendicolarmente al punto in cui è stato inserito. Posizionare il tampone con il lato di cotone rivolto verso il basso direttamente in una provetta da microcentrifuga etichettata con terreni BHI.

Applicare un collirio sull'occhio tamponato. Se lo si desidera, acquisire tamponi di pelle o pelliccia per campioni di controllo, sterilizzando adeguatamente i guanti tra ogni tampone. Al termine, rimetti il mouse nella gabbia. Lasciare riposare il tampone per 10-15 minuti sul ghiaccio. Quindi, sterilizzare le mani guantate e rimuovere il tampone mescolando la punta nel terreno per 10 rotazioni. Estrarre il tampone facendo roteare la punta contro la parete interna della provetta per cinque rotazioni e smaltirlo in un contenitore a rischio biologico. Ripeti il processo per ogni mouse.

Arricchire il campione incubando le provette staticamente per 1 ora a 37 gradi Celsius. Durante l'incubazione, etichettare una piastra TSA a temperatura ambiente per tampone oculare di topo o tampone di controllo e dividerla a metà. Estrarre i campioni arricchiti dall'incubatore e metterli sul ghiaccio. Agitare brevemente i campioni per mescolarli. Quindi, aliquotare 10 microlitri di campione sulla piastra TSA e inclinare la piastra per formare una striscia. Ripeti l'operazione due volte.

Sull'altro lato della linea di demarcazione della piastra, creare 10 punti con 10 microlitri di campione ciascuno. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 18 ore, 2 giorni e 4 giorni in una camera pulita che impedisca l'essiccazione delle piastre di agar. Conta le colonie nelle strisce. Annotare la morfologia e calcolare le unità formanti colonie per tampone per isolati morfologicamente simili.