Isolamento delle cellule interstiziali valvolari di topo: un metodo enzimatico per isolare e coltivare VIC dalla valvola aortica di topo

La valvola aortica del cuore è una struttura a tre lembi composta dalle cellule interstiziali della valvola interna o VIC distribuite in tutta la densa matrice extracellulare e dalle cellule endoteliali valvolari sovrastanti o VEC.

Per isolare i VIC, in primo luogo, preparare un topo soppresso in posizione supina. Attraverso l'incisione addominale e toracica della linea mediana, esporre il cuore. Fai una piccola incisione tra l'atrio sinistro e il ventricolo seguita da perfusione salina per drenare il sangue. Recidere l'aorta ascendente a livello dell'arco aortico e prelevare il cuore.

Analizza e scarta i due terzi distali dei ventricoli prima di sezionare longitudinalmente la parte rimanente del cuore per rivelare i lembi della valvola aortica a forma di U. Accisare i lembi e sciacquare con un tampone freddo per rimuovere il sangue.

Successivamente, trattare i lembi con una soluzione di collagenasi a bassa concentrazione e incubare. A basse concentrazioni, la collagenasi - un enzima proteolitico - rompe solo parzialmente la matrice extracellulare, rimuovendo i VEC superficiali dai lembi.

Centrifugare e sostituire il surnatante contenente enzima con il tampone, trasferendo il pellet risospeso in una capsula di Petri. Raccogliere i lembi e trattarli con una soluzione di collagenasi ad alta concentrazione per la seconda digestione. Dopo l'incubazione, la collagenasi degrada ulteriormente la matrice extracellulare, rilasciando i VIC in soluzione.

Centrifuga per pellettare i VIC e ririporli in mezzi adatti. Infine, seminare un basso volume della sospensione cellulare su una piastra multipozzetto per facilitare l'adesione dei VIC al fondo del pozzetto. Incubare per consentire ai VIC di proliferare.

Prima di iniziare l'esperimento, pulire e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e l'area di lavoro con etanolo al 70% e sterilizzare in autoclave gli strumenti chirurgici per 30 minuti. Quando la configurazione iniziale è pronta, inizia con la pulizia del torace e della regione addominale di un topo di 8 settimane soppresso con etanolo.

Usando le forbici, apri l'addome e il torace del topo. Quindi, tagliare tra l'atrio sinistro e il ventricolo sinistro con piccole forbici chirurgiche. Togliere il sangue dal cuore perfondendo 10 millilitri di PBS freddo e tagliare il cuore mantenendo 3 millimetri dell'aorta ascendente. Sotto uno stereomicroscopio, sezionare la valvola aortica tagliando il cuore orizzontalmente al centro dei ventricoli e tagliando il ventricolo sinistro verso l'aorta. Quindi, sezionare con cura la valvola aortica. Raggruppare le valvole in una piccola piastra di coltura tissutale da 35 millimetri.

Lavare le valvole isolate in una piastra di coltura cellulare da 75 millilitri con 5 millilitri di HEPES freddo da 10 millimolari appena preparato e integrato con antibiotici e incubare in 5 millilitri di collagenasi di tipo I per 30 minuti a 37 gradi Celsius agitando continuamente. Dopo l'incubazione, centrifugare la provetta per 5 minuti a 150 x g e lavare il pellet una volta con 2 millilitri di HEPES millimolare con vortice ad alta velocità per 30 secondi.

Raccogliere la sospensione risultante dalla provetta in un piatto di coltura da 35 millimetri e utilizzare una pinzetta sottile per trasferire con cura i frammenti di tessuto in una provetta nuova. Quindi, incubare il pellet in una provetta da 15 millilitri a 5 millilitri di collagenasi di tipo I a 37 gradi Celsius in agitazione continua per 35 minuti. Separare le cellule risospendendole con una pipetta da 1 millilitro e centrifugare a 150 x g per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Pulire le celle due volte risospendendo il pellet separato in 2 millilitri di DMEM completo e centrifugando a 150 x g per 5 minuti a 4 gradi Celsius.

Per la piastratura, risospendere il pellet in 1 millilitro di terreno completo e aggiungerlo a un pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti in una quantità minima di terreno. Mantieni le piastre indisturbate a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dopo 3 giorni di incubazione, confermare la crescita più vicino ai detriti tissutali osservando le cellule al microscopio. Una volta visibili 1.000 cellule, rimuovere con cura i detriti di tessuto con una pinzetta autoclavata e cambiare il terreno.