Perché l'imaging longitudinale è importante per la validazione degli obiettivi nelle malattie metaboliche?

L'imaging longitudinale consente l'osservazione ripetuta della dinamica cellulare nello stesso animale nel tempo, permettendo ai ricercatori di valutare la durata e la coerenza degli effetti mediati dal bersaglio sulla funzione delle cellule beta e sull'architettura degli isolotti, il che supporta decisioni più affidabili di tipo go/no-go nei programmi di validazione del bersaglio.

In che modo l'isolamento delle isole pancreatiche dai movimenti intestinali migliora la qualità dei dati?

La finestra di imaging supportata da una piastra metallica separa spazialmente il pancreas dall'intestino, riducendo gli artefatti di movimento causati dalla peristalsi e permettendo un'acquisizione stabile e ad alta risoluzione delle strutture cellulari, fondamentale per misurazioni quantitative affidabili nello sviluppo di saggi.

Quali misurazioni quantitative consentono la valutazione della funzione delle cellule beta in questo modello?

Il metodo consente la misurazione della migrazione delle cellule beta, del flusso di calcio intracellulare, delle dimensioni degli isolotti e della perfusione vascolare mediante imaging a intervalli di tempo e a stack z, fornendo letture funzionali che collegano interventi genetici o farmacologici a esiti fenotipici in un sistema rilevante per la malattia.

Perché i requisiti di replicazione sono importanti per la collaborazione interfunzionale nei saggi basati sull'imaging?

La replicazione garantisce che i risultati dell'imaging siano coerenti tra animali, operatori e ripetizioni sperimentali, elemento fondamentale per avere fiducia nei risultati del saggio e permettere confronti affidabili degli effetti dei composti tra team di scoperta, traslazionali e preclinici.

Quali capacità di analisi statistica sono necessarie prima di implementare l'imaging intravitale in un percorso di scoperta?

L'implementazione richiede capacità di analisi quantitativa delle immagini, inclusi il tracciamento dell'intensità di fluorescenza, la segmentazione degli oggetti e le statistiche su serie temporali, per confrontare le condizioni e valutare il significato delle variazioni osservate nella dinamica o nella struttura cellulare.

Imaging intravitale: un metodo per l'osservazione a livello cellulare del pancreas di topo attraverso una finestra di imaging stabilizzata

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biologia

0 visualizzazioni • 3:40 min • July 8th, 2025

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L'imaging intravitale prevede la visualizzazione delle cellule di un animale vivo attraverso una finestra di imaging impiantata nell'animale. Consente l'osservazione a lungo termine delle dinamiche cellulari senza comprometterne le funzioni.

Per iniziare, prendi un topo transgenico anestetizzato precedentemente impiantato con una finestra di imaging pancreatico supportata da una piastra metallica. La placca di base separa spazialmente il pancreas dall'intestino, riducendo così gli artefatti di movimento dovuti a movimenti fisiologici come la peristalsi.

Il topo transgenico esprime la proteina fluorescente verde o GFP sotto il promotore del gene dell'insulina espresso nelle cellule beta delle isole del pancreas.

Quindi, tieni saldamente la coda del topo e spruzza il disinfettante per rimuovere eventuali contaminanti superficiali. Inserire un catetere nella vena di coda laterale. Iniettare una soluzione contenente anticorpi marcati con una sonda fluorescente rossa nella vena caudale. Questi anticorpi si legano alle cellule che rivestono i vasi sanguigni, colorandoli di rosso.

Ora, sposta il mouse su una configurazione di microscopia intravitale. Inserire la finestra di imaging pancreatico nel supporto della finestra. Avviare l'imaging a basso ingrandimento per individuare i gruppi di isole fluorescenti verdi circondati da vasi sanguigni fluorescenti rossi. Aumentare l'ingrandimento per ottenere immagini di alta qualità a livello cellulare delle singole cellule beta.

Iniziare accendendo il microscopio intravitale, compresa la potenza del laser. Per inserire un catetere vascolare, esercitare pressione sul lato prossimale della coda con l'indice e il terzo dito. Se necessario, riscaldare la coda con una lampada. Disinfettare la vena caudale con uno spray di etanolo al 70%, quindi inserire un catetere calibro 30 nella vena caudale laterale e visualizzare il rigurgito di sangue nel tubo PE-10. Applicare del nastro di seta sul catetere per stabilizzarlo.

Iniettare destrano FITC e destrano TMR, o altre sonde fluorescenti, a seconda dei casi, secondo la combinazione di sonde fluorescenti. Inserire una sonda rettale per controllare automaticamente la temperatura corporea con il sistema di termoforo omeotermico. Quindi, inserire la finestra di imaging pancreatico preparata durante l'impostazione della microscopia intravitale nel supporto della finestra. Trasferire il mouse dalla piattaforma chirurgica al tavolino di imaging.

Per eseguire l'imaging intravitale, iniziare con l'imaging del pancreas a un basso ingrandimento, ad esempio quattro volte, per scansionare l'intera vista del pancreas nella finestra di imaging pancreatico. Una volta determinata la regione di interesse, passare a un obiettivo con ingrandimento più elevato, ad esempio 20 volte o 40 volte, per eseguire l'imaging a livello cellulare con risoluzione laterale e assiale rispettivamente di circa 0,5 micrometri e 3 micrometri.

Esegui l'imaging z-stack o time-lapse per osservare la struttura 3D o le dinamiche a livello cellulare, come la migrazione cellulare.