JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 visualizzazioni • 4:44 min • July 8th, 2025
Inizia posizionando un topo anestetizzato in posizione supina. Seziona la cavità toracica per visualizzare il cuore. Utilizzare un pipettatore dotato di una punta a foro largo per applicare la pressione di aspirazione e aspirare il cuore dal corpo del topo alla punta. Asportare il cuore all'aorta per raccoglierlo dal corpo del topo.
Immergere il cuore isolato in un becher contenente un tampone ricco di sostanze nutritive integrato con un agente anticoagulante. L'anticoagulante nel tampone forma un complesso con il calcio presente nei cardiomiociti, le cellule del muscolo cardiaco, cessando la contrazione dei muscoli cardiaci e prevenendo la coagulazione del sangue.
Quindi, posizionare il cuore con l'apice rivolto verso il basso su un supporto per il cuore tenuto in una capsula di Petri contenente un tampone adatto. Bloccare l'aorta sopra gli atri e trasferire il cuore bloccato su una placca di perfusione.
Successivamente, prelevare un gruppo siringa-ago contenente un tampone di perfusione appropriato. Inserire l'ago nel ventricolo sinistro perforando la camera ventricolare.
Con l'aorta bloccata, l'iniezione intraventricolare pressurizza le valvole aortiche per aprirle. Di conseguenza, il tampone scarica il sangue in modo anterogrado attraverso le arterie coronarie, perfondendo completamente i muscoli cardiaci. Infine, il tampone si diffonde attraverso le vene polmonari. Ciò fornisce un cuore perfuso con successo per le applicazioni a valle.
Per il prelievo del cuore di topo, dopo aver confermato l'eutanasia e rasato l'addome, aprire rapidamente la cavità toracica per esporre il cuore e utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica con la punta tagliata approssimativamente alle dimensioni del cuore, per aspirare il cuore nella pipetta. Sollevare la pipetta per creare spazio sufficiente per inserire le forbici curve e utilizzare le forbici per asportare il cuore dal lato dorsale, facendo attenzione a non danneggiare gli atri.
Immediatamente, metti il cuore in un becher di vetro da 30 millilitri contenente CIB EGTA ghiacciato per circa 1 minuto. Quando le contrazioni si sono fermate, posizionare il cuore in una piastra di coltura da 35 millilitri contenente CIB EGTA ghiacciato e rimuovere il polmone e altri tessuti visibili.
Posizionare il cuore pulito grossolanamente su un supporto per cuore riempito con CIB EGTA raffreddato, con l'apice rivolto verso il basso, e posizionare il supporto sotto un microscopio stereoscopico. Rimuovere il grasso e i tessuti connettivi intorno all'aorta. Se la lunghezza dell'aorta tagliata è troppo lunga, tagliare l'aorta appena sotto l'arteria brachiocefalica e orientare il cuore in modo che la superficie anteriore sia rivolta in avanti. Usa una pinzetta per sollevare l'estremità dell'aorta e usa un piccolo morsetto vascolare per bloccare l'aorta vicino agli atri, mentre spingi delicatamente verso il basso gli atri.
Quindi, posizionare il cuore clampato su una piastra di perfusione, con il lato anteriore rivolto verso l'alto, e idratare il cuore con alcune gocce di CIB EGTA. Per la perfusione anterograda, caricare sulla pompa di infusione una siringa da 20 millilitri contenente CIB EGTA preriscaldato collegata a un tubo di prolunga flessibile e a un ago per iniezione contrassegnato e avviare la pompa a una portata di 0,5 millilitri al minuto. Quando l'ago e la pompa sono stati riempiti, posizionare l'ago per iniezione sulla piastra di perfusione, con il lato più corto della forma diagonale in avanti, e far scorrere l'ago fino a toccare appena l'apice del cuore.
Con cautela, inserire l'ago vicino all'apice del ventricolo sinistro, nella camera ventricolare senza torcere o staccare l'ago dalla placca, osservando il segno per stimare la profondità di inserimento dell'ago. Quando l'inserimento dell'ago è completo, il sangue dovrebbe iniziare a fluire dall'arteria coronaria.
Utilizzare del nastro adesivo per fissare l'ago di iniezione alla piastra e aumentare la velocità della pompa a 1 millilitro al minuto. Se il cuore viene perfuso con successo, il flusso del tampone nel capillare dovrebbe essere visibile appena sotto l'epicardio.