Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere un'efficace trasfezione genica nel sistema nervoso centrale del topo embrionale in un determinato momento dello sviluppo e in una specifica area del cervello. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando capillari di precisione ed elettrodi a forma di ago per prevenire danni all'utero. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'apprendere un metodo particolare di immobilizzazione degli embrioni, utilizzando un cavo a fibra ottica per visualizzare embrioni di piccole dimensioni e consentire l'iniezione mirata del DNA.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'eseguire un'elettroporazione con elettrodi di tipo a stecca sulla superficie uterina al fine di trasfettare il DNA nelle parti superficiali del cervello; l'ultimo passaggio della procedura prevede invece l'elettroporazione con elettrodi di tipo a ago in strutture più profonde del cervello, come il talamo e l'ipotalamo. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano una trasfezione specifica per strato corticale o una trasfezione efficiente nel talamo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la normale in utero electroporation, è rappresentato dalla maggiore visibilità e controllo del sito di elettroporazione degli embrioni all'interno dell'utero.

Utilizziamo un cavo simile a una fibra ottica, che permette di visualizzare gli embrioni a partire dal giorno E 9,5 e di iniettare con aghi ipodermici il DNA plasmidico nella parte più profonda del cervello, come il talamo e l'ipotalamo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sullo sviluppo del cervello, come la differenziazione neuronale, il patterning cerebrale e la connettività neurale. In generale, le persone alle prime armi con questa tecnica incontrano difficoltà perché è complesso modellare l'ago e il tracciato elettrico e ottenere una posizione corretta.

L'utero e gli embrioni. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per comprendere come realizzare elettrodi aghiformi precisi e come posizionare gli embrioni per l'elettroporazione. Poiché questi due passaggi sono cruciali per ottenere risultati soddisfacenti. Per preparare i capillari, utilizzare un estrattore di micropipette seguendo le istruzioni del produttore.

In questa procedura, utilizziamo tubi capillari di vetro di un millimetro di diametro senza fibra interna. Le punte delle micropipette, tirate, dovrebbero misurare da 800 micrometri a un millimetro a partire dall'estremità, con un diametro esterno inferiore a 60 micrometri; utilizzando un microscopio stereoscopico e una pinzetta, schiacciare le estremità delle micropipette fino a ottenere un diametro compreso tra 20 e 30 micrometri. Misurare ogni micropipetta utilizzando un micrometro.

Successivamente, preparare microelettrodi mediante avvolgimento. Avvolgere un'estremità di un filo di tungsteno attorno a un perno placcato in oro. Utilizzare filo di tungsteno per gli elettrodi negativi e filo di platino per gli elettrodi positivi.

Fissare il filo al perno con param. Inserire quindi il filo nell'asta di plastica di un bastoncino di ovatta e avvolgere entrambe le estremità con phim; affilare uniformemente la punta del filo con carta vetrata fine fino a raggiungere da 20 a 30 micrometri alla punta e 60 micrometri tra 800 micrometri e un millimetro dalla punta. Verificare nuovamente le dimensioni finali con un micrometro.

Successivamente, immergere il filo affilato in una goccia di smalto per unghie per applicare un sottile strato sull'intero filo, a scopo isolante. Dopo che lo smalto per unghie si è asciugato, utilizzare un bastoncino di ovatta imbevuto di acetone per rimuoverlo dagli ultimi 200 micrometri della punta del filo. Gli elettrodi in platino vengono acquistati già pronti e non richiedono preparazione.

In questa procedura, utilizziamo l'elettrodo genico CUY sei 10 P quattro trattino uno nepo per purificare il DNA plasmidico con un metodo maxi prep o equivalente, eluendo 100 microgrammi di DNA in un nuovo tubo e aggiungendo 10 microlitri di colorante fast green all'1%. Utilizzare il tampone TE per portare il volume a 100 microlitri, ottenendo una concentrazione finale di DNA plasmidico di 1 microgrammo per microlitro. Mescolare delicatamente la soluzione mediante pipettaggio, quindi centrifugare la soluzione di DNA per cinque minuti a 14.000 g a temperatura ambiente per rimuovere impurezze e sali.

Trasferire il SNAT in un nuovo tubo. La soluzione di DNA può essere mantenuta a temperatura ambiente nel tubo per tutta la durata della procedura. Successivamente, collegare un ago tirato a un micromanipolatore seguendo le istruzioni del produttore, immergere la punta dell'ago nella soluzione di DNA per riempire l'ago.

Mettere da parte con cura il micromanipolatore e prepararsi all'intervento chirurgico prima dell'intervento. Pesare un topo gravido ai giorni embrionali 9,5-15,5 per determinarne il peso corporeo.

Quindi intraperitoneale. Iniettare pentobarbital sodico di grado farmaceutico a 50 microgrammi per grammo di peso corporeo e attendere cinque minuti. Alternative al pentobarbital sodico potrebbero includere chetamina, xilazina, iniezione o anestetici gassosi.

Dopo l'anestetizzazione, utilizzare una lametta e alcol al 50% per rasare i peli dall'addome. Preparare la cute con alternati lavaggi di Betadine e alcol al 70%. Praticare un'incisione lungo la linea mediana addominale con forbici fini.

Estrarre con attenzione tutti i corni uterini su una garza di cotone inumidita con soluzione salina fosfato al 1x o PBS, posizionata attorno alla ferita. Mantenere l'utero costantemente umido con PBS. Utilizzando un cavo a fibra ottica flessibile.

Posizionare il cavo sotto il corno uterino. Posizionare l'utero tra la luce della fibra ottica e il pollice e premere delicatamente per spingere l'embrione verso la parete uterina. Quando l'embrione è posizionato con la testa a sinistra e rivolta verso l'alto, inserire con attenzione la capillare di vetro nel ventricolo bersaglio e iniettare circa un microlitro di soluzione di DNA per l'elettroporazione del quarto strato corticale al giorno embrionale 13,5.

Posizionare elettrodi di platino a forma di bacchetta all'esterno dell'utero ed applicare impulsi di corrente a forma d'onda quadra cinque volte utilizzando 38 volt per 50 millisecondi. Se si utilizza l'elettroporazione micro per raggiungere il talamo o l'ipotalamo al giorno embrionale 10,5, inserire l'elettrodo negativo in tungsteno sottile nel ventricolo iniettato con DNA e l'elettrodo positivo in platino nell'utero. Posizionare la regione bersaglio tra le estremità di entrambi gli elettrodi ed applicare impulsi di corrente a forma d'onda quadra suggeriti tre volte a sette volt per 100 millisecondi.

Al termine dell'elettroporazione, riposizionare la corna uterina nella sua posizione originale e aggiungere 500 microlitri di PBS. Suturare lo strato interno dell'incisione con un punto chirurgico. Quindi chiudere lo strato esterno con una clip automatica da nove millimetri.

Posizionare il topo su un tappetino riscaldante per due ore per permettere il recupero dall'intervento chirurgico e dall'anestesia. Qui l'elettroporazione con platino della regione corticale viene applicata nei giorni embrionali 13,5, 14,5 e 15,5. I cervelli sono stati prelevati nel periodo postnatale.

Giorno sei. Lo strato di cellule corticali elettroporato è chiaramente diverso in ogni esperimento. Questo suggerisce che l'elettroporazione dipendente dal tempo rende possibile un aumento o una perdita di funzione specifici per i diversi strati corticali.

Come mostrato qui, l'elettroporazione in un tessuto profondo come il talamo e l'ipotalamo. L'uso di elettrodi in platino rigidi spesso dà un'efficienza bassa; utilizzando elettrodi microscopici per elettroporare, questi tessuti profondi offrono un'efficienza e una vitalità migliori.

Abbiamo iniettato una soluzione di DNA plasmidico nel terzo ventricolo di embrioni di topo. Al giorno embrionale 11,5, abbiamo applicato un'elettroporazione con ago limitata al talamo, poiché la maggior parte degli esoni del talamo proietta nella corteccia entro il sesto giorno postnatale. Qui mostriamo l'elettroporazione microscopica P-C-A-G-E-Y-F-P nel cefalo in via di sviluppo.

La regione del talamo è mostrata da RORC, che etichetta tutti i neuroni post-mitotici talamici. Le proiezioni assonali, indicate da frecce bianche verso il quarto strato della corteccia, possono essere visualizzate anche mediante EYFP, che riempie l'intero neurone. La posizione del quarto strato nella corteccia è inoltre etichettata dall'anticorpo anti-RORC.

Una volta avviato il MA, questa tecnica può essere eseguita in 15 minuti per litro se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di maneggiare con grande attenzione il test per prevenire eventuali danni. Altri metodi, come l'incorporazione di un cromosoma specifico nel DNA mitocondriale, possono essere eseguiti al fine di comprendere il meccanismo molecolare della specificazione cellulare dopo lo sviluppo.

Questa tecnica fornisce agli studiosi nel campo dello sviluppo del sistema nervoso centrale uno strumento per esplorare i meccanismi molecolari coinvolti nel patterning, nella crescita assonale e nella formazione dei circuiti.