Isolamento delle cellule IPE e RPE: una tecnica per ottenere cellule epiteliali del pigmento oculare dall'occhio di coniglio

Le cellule epiteliali pigmentate sono cellule cuboidali terminalmente differenziate collegate da giunzioni strette. Queste cellule epiteliali che rivestono l'iride sono le cellule epiteliali del pigmento dell'iride o IPE, e quelle vicino alla retina sono le cellule epiteliali del pigmento retinico o RPE.

Per estrarre queste cellule, prendi un occhio di coniglio intatto. Trattare l'occhio con un disinfettante per rimuovere eventuali microrganismi dalla superficie dell'occhio. Lavare via il disinfettante con una soluzione tampone. Fai un'incisione vicino all'iride. Usando questa apertura, fai un taglio circolare completo lungo il confine dell'iride, dividendo l'occhio in un segmento anteriore contenente l'iride e una parte posteriore che comprende la retina e l'umor vitreo.

Prendi il segmento anteriore e scarta la lente per accedere all'iride. Togliete l'iris e mettetela su un piatto di coltura. Successivamente, prendere il segmento posteriore e scartare l'umor vitreo gelatinoso e la retina dal bulbo oculare.

Trattare l'iride e il bulbo oculare con tripsina e incubare. La tripsina degrada la giunzione stretta e le proteine della matrice extracellulare, avviando la dissociazione delle cellule epiteliali. Scartare la tripsina e aggiungere un terreno di coltura adatto. Raschiare delicatamente l'iride e la superficie del bulbo oculare per rilasciare le cellule epiteliali nel terreno.

Infine, seminare le cellule IPE e RPE in pozzetti separati. Le cellule sono pronte per ulteriori saggi a valle.

Dopo l'eutanasia dell'animale, usa le forbici curve e le pinze Colibrì per enucleare gli occhi, quindi pulisci il tessuto muscolare rimanente e la pelle dagli occhi. Raccogliere gli occhi in una provetta da 50 millilitri riempita con PBS non sterile e trasferire la provetta nella cappa a flusso laminare. Disinfettali immergendoli in una soluzione a base di iodio per due minuti, quindi trasferisci gli occhi in una provetta da 50 millilitri riempita con PBS sterile.

Metti un occhio su un impacco di garza sterile e tieni saldamente l'occhio vicino al nervo ottico, quindi taglia vicino al limite dell'iride con un bisturi #11. Usando le forbici, taglia intorno all'iride e rimuovi il segmento anteriore e mettilo in una capsula di Petri lasciando il bulbo con il vitreo, fino a quando le cellule epiteliali pigmentate retiniche, o RPE, non sono isolate.

Per isolare l'epitelio pigmentato dell'iride o le cellule IPE, rimuovere il cristallino con una pinza fine ed estrarre delicatamente l'iride contenente le cellule IPE. Metti l'iris in una capsula di Petri e lavala con PBS sterile. Aggiungere 500 microlitri di tripsina allo 0,25% e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Rimuovere la tripsina, aggiungere 500 microlitri di terreno completo e raschiare delicatamente l'IPE con una pipetta Pasteur piatta lucidata a fuoco.

Raccogli la sospensione cellulare e mettila in una provetta da 1,5 millilitri. Contare le cellule utilizzando la camera di Neubauer e seminare 0,2 milioni di cellule per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti con 1 millilitro di terreno completo. Metti la piastra in un incubatore e coltivala a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.

Per isolare le cellule RPE, rimuovere l'umor vitreo e la retina dal segmento posteriore con una pinza sottile. Metti i bulbi in una piastra a 24 pozzetti e aggiungi 500 microlitri di tripsina allo 0,25% per occhio e incuba per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Rimuovere la tripsina, aggiungere 500 microlitri di terreno completo per globo e raschiare delicatamente le cellule RPE con una pipetta Pasteur curva lucidata a fuoco.

Raccogli la sospensione cellulare e mettila in una provetta da 1,5 millilitri. Contare le cellule utilizzando la camera di Neubauer e seminare le cellule come descritto in precedenza. Posizionare la piastra nell'incubatrice.