Modello di biofilm di polmone di maiale ex vivo: una tecnica per sviluppare un modello polmonare per studiare i biofilm batterici su tessuto bronchiolare di maiale

I bronchioli sono le vie aeree tubulari dei polmoni. Durante l'infezione cronica, i bronchioli si intasano a causa dell'accumulo di muco. Il muco ricco di sostanze nutritive fornisce un ambiente adatto alla crescita dei batteri opportunisti. Questi batteri vengono incorporati in una matrice polimerica extracellulare autoprodotta e proliferano per formare un biofilm.

Per imitare lo sviluppo del biofilm batterico sui polmoni, prelevare un campione di tessuto bronchiolare di maiale in una capsula di Petri. Sezionare il tessuto in pezzi della forma desiderata. Aggiungere un terreno di coltura biofilm alla capsula di Petri. Sterilizzare la piastra sotto la luce UV per rimuovere eventuali contaminanti superficiali.

Trasferire i pezzi di tessuto sterilizzati in una piastra multipozzetto contenente terreni di coltura per biofilm e tamponi di agarosio, che fungono da substrato ottimale per l'adesione batterica. Quindi, pungere la punta di un ago contenente una colonia dei batteri desiderati su ogni pezzo di tessuto per introdurre i batteri planctonici nel tessuto. Sigillare la piastra con una membrana porosa sterilizzata ai raggi UV che facilita lo scambio uniforme di ossigeno su tutta la superficie della piastra. Incubare la piastra sigillata.

Durante l'incubazione, i batteri aderiscono irreversibilmente alla superficie epiteliale attraverso i pili e iniziano a secernere la matrice extracellulare. All'interno della matrice, i batteri utilizzano le fonti di energia, la mucina e il DNA libero dai terreni di coltura per formare biofilm. Il modello di biofilm batterico è pronto per ulteriori test.

Posizionare le bronchiole nel primo lavaggio DMEM/RPMI 1640. Lasciarlo nel lavaggio e raccogliere ulteriori sezioni di bronchiolo dallo stesso polmone per produrre sezioni di tessuto sufficienti per l'esperimento pianificato. Inserire eventuali sezioni bronchiolari aggiuntive dello stesso polmone nel lavaggio e lasciarle nel lavaggio per almeno due minuti.

Rimuovere i bronchioli dal primo lavaggio e porre i campioni in una capsula di Petri sterile. Tenere leggermente ogni bronchiolo con una pinza sterile, facendo attenzione a non danneggiare il tessuto. Rimuovere il più possibile il tessuto molle rimanente e tagliare il tessuto in strisce larghe cinque millimetri utilizzando le forbici sterili per dissezione.

Posizionare tutte le strisce di tessuto bronchiolare nel secondo lavaggio DMEM/RPMI 1640. Lasciatele in lavatrice per almeno due minuti. Quindi, rimuovere le strisce di tessuto dal secondo lavaggio utilizzando una pinza sterile e metterle in una capsula di Petri pulita e sterile. Rimuovere i tessuti molli rimanenti attaccati al bronchiolo e tagliare le strisce in quadrati usando le forbici sterili per dissezione.

Aggiungere il terzo lavaggio DMEM/RPMI 1640 nella piastra di Petri e mescolare leggermente i pezzi di tessuto nel lavaggio facendo roteare la piastra. Versare il terzo lavaggio dalla capsula di Petri senza rimuovere i pezzi di tessuto.

Quindi, aggiungere il lavaggio SCFM finale, assicurandosi che tutti i pezzi di tessuto siano coperti. Sterilizzare il fazzoletto in SCFM sotto la luce UV per cinque minuti. Utilizzare una pinza sterile per trasferire ogni pezzo di tessuto bronchiolare sterilizzato nei singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente tamponi di agarosio SCFM.

Per infettare ogni pezzo di tessuto con il ceppo batterico desiderato, toccare una colonia cresciuta su una piastra di agar con la punta di un ago calibro 29 attaccato a una siringa da insulina sterile da 0,5 millilitri. Quindi, tocca la colonia sul pezzo di tessuto, pungendo delicatamente la superficie. Per i controlli non infetti, pungere delicatamente la superficie del pezzo di tessuto con la punta dell'ago.

Quindi, utilizzare una pipetta per aggiungere 500 microlitri di SCFM a ciascun pozzetto. Sterilizzare una membrana sigillante traspirante per ogni piastra a 24 pozzetti sotto la luce ultravioletta per 10 minuti. Rimuovere il coperchio dalla piastra a 24 pozzetti e sostituirlo con la membrana traspirante. Quindi, incubare le piastre a 37 gradi Celsius senza agitare.