0 visualizzazioni • 3:57 min. • July 8th, 2025
Per la coltura del segmento oculare anteriore, iniziare con un piatto di coltura adatto. La piastra di coltura ha un palco rialzato al centro, collegato a due porte del fluido per l'afflusso e il deflusso.
Innanzitutto, posiziona un segmento di occhio anteriore suino fresco contenente la cornea sul tavolino. Successivamente, posizionare un anello di bloccaggio sul segmento dell'occhio e fissarlo. Successivamente, preparare un set-up di perfusione comprendente una siringa riempita con un terreno di coltura adatto. Collegare la siringa a una valvola, un filtro e un tubo con un mozzo dell'ago piegato all'altra estremità.
Preparare un serbatoio assemblato in modo simile utilizzando una siringa vuota. Ora, collegare i mozzi dell'ago della perfusione e la configurazione del serbatoio rispettivamente alle porte di afflusso e di uscita. Perfondere delicatamente il terreno e lasciare che il segmento anteriore si gonfi.
Continuare la perfusione e lasciare che le bolle e il mezzo in eccesso fluiscano nel serbatoio. Successivamente, incubare la piastra di coltura all'altezza desiderata e alle condizioni fisiologiche standard. Il risultato è un modello tridimensionale che simula la complessa architettura dell'occhio in condizioni fisiologiche.
Collegare un trasduttore di pressione alla valvola del serbatoio per monitorare costantemente la pressione oculare. Il segmento anteriore dell'occhio è ora pronto per l'uso per ulteriori esperimenti.
Dopo aver posizionato il segmento anteriore nella capsula di Petri, bagnare un batuffolo di cotone nel terreno e tamponare delicatamente al centro della cornea per rimuovere il pigmento. Tenere gli occhi con una pinza e rimuovere il pigmento in eccesso intorno alla sclera strofinando. Posizionare il segmento anteriore invertito sulla regione rialzata del piatto inferiore, assicurandosi che la cornea rimanga al centro della regione rialzata.
Posizionare l'anello di serraggio sopra il segmento anteriore appena posizionato e serrare delicatamente le viti con la chiave a brugola. Collegare entrambi i connettori fluidici con O-ring alle porte filettate sul fondo del piatto. Al primo connettore fluidico, collegare il mozzo dell'ago piegato a 90 gradi calibro 18, un pezzo di tubo, un mozzo dell'ago calibro 18, un filtro per siringa in nylon, una valvola a tre vie e una siringa da 20 millimetri riempita di fluido.
Al secondo connettore fluidico, collegare il mozzo dell'ago piegato a 90 gradi calibro 18, un pezzo di tubo, un mozzo dell'ago calibro 18, una valvola a tre vie, come dimostrato per il primo connettore del fluido, quindi collegare la parte del cilindro di una siringa sterile da 10 millilitri, che fungerà da serbatoio per raccogliere il liquido e le bolle.
Mantenendo le valvole a tre vie aperte in modo appropriato alle siringhe, spingere delicatamente il fluido attraverso il sistema utilizzando la porta del connettore del primo fluidico. Per gonfiare il segmento anteriore, riempire il tubo con il fluido ed eventualmente riempire il serbatoio. Rimuovere le bolle spingendo delicatamente il supporto nel piatto e capovolgere il piatto per espellere le bolle.
Posizionare la piastra per coltura d'organo del segmento anteriore nell'incubatore per colture cellulari. Dirigere le linee dei tubi attraverso la parte inferiore della porta dell'incubatrice per evitare interferenze con l'apertura e la chiusura della porta. Posizionare le tubazioni con il serbatoio sullo strumento trasduttore di pressione. Collegare la valvola a tre vie laterale alla configurazione del trasduttore di pressione mentre il PBS scorre attraverso la linea per evitare che le bolle d'aria entrino nelle linee dei tubi.