Generazione di fette ventricolari suine: una tecnica basata sul vibratomo per preparare fette ultrasottili di tessuto cardiaco di maiale

Le fette di tessuto cardiaco dei mammiferi - fette ultrasottili di tessuto cardiaco ventricolare vitale dei mammiferi - conservano l'architettura e la fisiologia del tessuto cardiaco, rendendole sistemi modello per la ricerca cardiovascolare traslazionale.

Per generare fette di tessuto cardiaco suino, mettere un cuore suino appena raccolto in un vassoio contenente una soluzione cardioplegica refrigerata, che interrompe temporaneamente l'attività cardiaca, proteggendo il cuore. Sezionare il cuore per isolare il ventricolo sinistro, quindi tagliarlo in blocchi di tessuto di dimensioni uniformi. Usando la colla per tessuti, fissare il blocco di tessuto in piano al blocco di agar prefabbricato fissato alla base del supporto del campione del vibratomo, con l'epicardio cardiaco - lo strato esterno del cuore - rivolto verso il basso.

Trasferire il portacampioni nel vassoio di affettamento del vibratomo raffreddato, ossigenato e riempito di tampone per mantenere le condizioni fisiologiche del tessuto e raffreddarlo durante l'affettatura. Regolare l'altezza della lama del vibratomo e i parametri di taglio in base allo spessore della sezione di tessuto desiderato. Durante la corsa, la lama vibrante avanza e penetra nel blocco di tessuto.

L'agar fornisce stabilità al blocco di tessuto durante l'affettatura e mantiene la lama su un percorso, generando fette uniformi di tessuto cardiaco intatto con fibre miocardiche allineate. Raccogliere e trasferire le fette di tessuto in un bagno tampone ossigenato per ridurre i danni ai tessuti. Le fette di tessuto cardiaco sono pronte per l'analisi a valle.

Per ottenere fette di tessuto cardiaco di maiale, per prima cosa, aggiungere ghiaccio alla camicia di raffreddamento del bagno di tessuto di un vibratomo e aggiungere la soluzione di Tyrode al bagno. Utilizzare un barattolo di plastica da 1 litro per raccogliere il deflusso di ghiaccio sciolto dalla camicia di raffreddamento del bagno in tessuto e trasferire i cuori di maiale in un vassoio contenente 1 litro di soluzione fresca, fredda e cardioplegica in una cappa di biosicurezza.

Utilizzare bisturi sterili retrattili per sezionare il cuore per isolare il ventricolo sinistro e utilizzare lame di rasoio rettangolari per tagliare il ventricolo sinistro in blocchi di 1 o 2 centimetri cubi. Metti da parte un blocco di tessuto per affettare e metti i pezzi di blocco di tessuto rimanenti in un tubo da 50 millilitri di soluzione fredda di Tyrode su ghiaccio.

Massaggiare delicatamente il blocco di tessuto riservato e aggiungere da 1 a 2 gocce di colla per tessuti al supporto del campione di metallo del vibratomo. Attacca un pezzo di blocco di agar al 4% con una superficie di circa 1 centimetro quadrato alla colla e aggiungi da 1 a 2 gocce di colla per tessuti all'agar.

Attacca il blocco cardiaco all'agar, con l'epicardio cardiaco rivolto verso il basso, con il tessuto il più piatto possibile contro il supporto, e posiziona il supporto del tessuto con il blocco cardiaco nel bagno di affettatura del vibratomo.

È fondamentale attaccare il blocco cardiaco all'agar con il lato dell'epicardio cardiaco rivolto verso il basso sulla colla del tessuto e assicurarsi che il tessuto sia il più piatto possibile.

Quindi, collegare il tubo dell'ossigeno al bagno di affettamento e il vassoio di metallo riempito con la soluzione di Tyrode e posizionare i filtri cellulari da 40 micrometri sul vassoio di metallo per raccogliere le sezioni di tessuto cardiaco mentre vengono affettate. Utilizzare il software operativo del vibratomo per regolare l'altezza della lama e del campione, in modo che la lama sia vicina alla parte superiore del tessuto, ma al di sotto dei muscoli papillari, e il liquido copra il tessuto e la lama.

Selezionare Avanza per regolare il punto da cui iniziare ad affettare il tessuto. Premere Slice per aumentare la velocità e utilizzare la manopola per spostare la lama verso il bordo del tessuto. Premere nuovamente Affetta per interrompere e Avanza per disattivare il processo. Quindi, regolare i parametri di taglio come indicato e premere Slice per iniziare ad affettare il tessuto. Quando la lama raggiunge l'estremità del tessuto, ma prima che colpisca l'estremità del supporto del campione, premere nuovamente Affetta per fermarsi e premere Invio per tornare alla posizione iniziale.

Quando le fette raggiungono la massima lunghezza e sembrano essere di buona qualità, utilizzare una pipetta di plastica Pasteur riempita con soluzione fredda di Tyrode per raccogliere delicatamente il tessuto dal bagno, usando pinze e forbici a molla per dislocare la fetta dal cuore se necessario. Posizionare ogni fetta raccolta in un colino a singola cellula nel bagno di Tyrode ossigenato e utilizzare la soluzione nella pipetta per premere il tessuto sulla superficie del filtro cellulare.