Isolamento delle cellule endoteliali aortiche suine (pAEC): un metodo basato su enzimi per isolare le cellule endoteliali dall'aorta addominale suina raccolta

L'aorta - l'arteria principale che trasporta il sangue ossigenato dal cuore al corpo - è composta da tre strati o "tuniche": un'intima interna, una media media e un'avventizia esterna. Le cellule endoteliali o EC sono presenti nell'intima come un sottile monostrato continuo su una membrana basale di supporto costituita da proteine strutturali, principalmente collagene.

Per isolare le EC, iniziare con un'aorta suina raccolta in un piatto di coltura. Asportare le sue estremità e qualsiasi tessuto aderente circostante per prevenire la contaminazione delle cellule non endoteliali. Lavare l'aorta con un tampone contenente antibiotici per inibire la crescita microbica.

Far passare una sutura chirurgica sterile attraverso l'aorta e legare una delle sue estremità, mantenendo la sutura all'interno del lume. Fissare l'estremità legata e ritrarre la sutura per invertire completamente l'aorta. Ciò espone l'intima contenente EC alla digestione enzimatica. Trattare l'aorta con una soluzione di collagenasi preriscaldata e a bassa concentrazione per un'attività enzimatica ottimale e incubare.

La collagenasi scompone le proteine del collagene presenti nella membrana basale sottostante le CE, avviando la loro dissociazione. Dopo l'incubazione, aggiungere un tampone refrigerato per inattivare gli enzimi collagenasi.

Raschiare delicatamente la superficie intimale aortica e sciacquarla con un tampone per rilasciare le EC in soluzione. Centrifugare questa soluzione per pellettare gli EC. Risospendere il pellet in un mezzo adatto. Seminare la sospensione cellulare in un pallone di coltura e incubare. Le EC aderiscono al fondo del pallone e proliferano.

Per l'isolamento delle cellule endoteliali dell'aorta suina, trasferire l'aorta di maiale in una piastra di Petri da 150 millimetri in condizioni asettiche e rimuovere delicatamente entrambe le estremità del vaso. Tagliare il tessuto in eccesso nel punto in cui il vaso era stato bloccato, con pinze e forbici sterili, e utilizzare da 20 a 50 millilitri di tampone di lavaggio fresco per risciacquare l'esterno e l'interno dell'aorta.

Quindi, fai passare una sutura chirurgica attraverso l'aorta e lega liberamente un'estremità del vaso, mantenendo la sutura all'interno del lume. Fissare delicatamente l'aorta vicino all'estremità legata con una pinza, quindi tirare lentamente le suture chirurgiche per invertire l'aorta fino a quando la superficie endoteliale dell'aorta non è esposta.

Lavare la superficie endoteliale dell'aorta tre volte con 10 millilitri di tampone di lavaggio fresco per lavaggio e posizionare l'aorta in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Coprire il campione con 10 millilitri di soluzione digestiva riscaldata allo 0,005% di collagenasi IV a 37 gradi Celsius e incubare il tessuto a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Al termine dell'incubazione, trasferire l'intero contenuto della provetta in una piastra di coltura da 100 millimetri e arrestare la digestione con 10-15 millilitri di tampone di arresto pre-raffreddato. Utilizzando un raschietto cellulare, rimuovere delicatamente le cellule endoteliali aortiche dalla superficie interna del vaso e lavare il vaso tre volte con 5 millilitri di tampone di lavaggio per lavaggio.

Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga da 50 millilitri e lavare il fondo della piastra di coltura due volte con 5 millilitri di tampone di lavaggio fresco per lavaggio, riunendo i lavaggi nella provetta da 50 millimetri.

Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e scartare tutti tranne gli ultimi 10 millilitri di surnatante. Aggiungere 20 millilitri di tampone di lavaggio per risospendere i pellet, facendo attenzione a evitare bolle, e raccogliere le celle con un'altra centrifugazione.

Risospendere il pellet in 1 millilitro di terreno di coltura cellulare per il conteggio e piastrare le cellule a una concentrazione di 1 x 10 per 6 cellule per 25 centimetri quadrati di matraccia. Quindi, posizionare le cellule nell'incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica, rinfrescando il terreno ogni 2 o 3 giorni.