Knockdown genico mediato da RNA a forcina corta in iHSPC in vitro: un sistema di espressione shRNA basato su lentivirus Consegna in iHSPC per il knockdown dell'espressione genica specifica

Iniziare con una cellula staminale e progenitrice ematopoietica immortalizzata, iHSPC, in terreni contenenti uno specifico ormone steroideo e citochina ematopoietica, che regolano la proliferazione cellulare in uno stato indifferenziato. Aggiungere un polimero cationico adatto e vettori lentivirali.

I virus ricombinanti trasportano sequenze codificanti per RNA a forcina corta, shRNA, diretti verso uno specifico gene ospite e un gene marcatore di resistenza agli antibiotici.

Centrifuga per sedimentare cellule e virus. Durante l'incubazione, i polimeri cationici neutralizzano le cariche della membrana cellulare, migliorando il legame virale. Dopo la fusione della membrana, il materiale genetico virale e gli enzimi vengono rilasciati nel citoplasma cellulare. Il genoma virale viene trascritto inversamente, si sposta nel nucleo e si integra nel genoma ospite.

Sotto l'influenza di uno specifico promotore nel costrutto, il costrutto genico shRNA che comprende una sequenza di corrispondenza dell'mRNA bersaglio, un segmento di loop e un'altra sequenza complementare al primo, viene trascritto formando shRNA con segmento di loop di nucleotidi spaiati. Dopo la trascrizione, l'shRNA viene espo