JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 5:12 min. • July 8th, 2025
Inizia aggiungendo il plasmide CRISPR all-in-one alle cellule immunitarie presenti in una provetta. Questo plasmide contiene un gene Cas9 in combinazione con l'sgRNA o la sequenza codificante l'RNA a guida singola, complementare alla sequenza bersaglio nel genoma ospite.
Aggiungere un plasmide donatore linearizzato contenente un transgene inserito tra bracci di omologia o HA, le ripetizioni del DNA necessarie per la ricombinazione omologa. Eseguire l'elettroporazione, che utilizza la corrente elettrica per iniettare la miscela plasmidica nella cellula. Una volta all'interno, l'sgRNA processato forma un complesso con la nucleasi Cas9 espressa.
L'sgRNA si lega al sito bersaglio, consentendo alla nucleasi Cas9 di identificare la specifica sequenza di riconoscimento nota come motivo adiacente al protospaziatore o PAM e di scindere il DNA ospite vicino ad esso. Questo crea una rottura a doppio filamento smussata in cui il macchinario cellulare reseca il DNA, generando sporgenze di 3'. La presenza di siti di fiancheggiamento dell'HA innesca il meccanismo di riparazione diretto dall'omologia in cui il DNA tagliato si unisce alla sequenza di HA, formando una struttura eteroduplex - il D-loop.
La sintesi del DNA continua, formando un filamento complementare alla sequenza transgenica fino a quando non si ricongiunge al filamento di DNA originale. La parte superiore del D-loop funge da modello per sintetizzare la parte mancante del DNA, generando le doppie giunzioni di Holliday, strutture in cui interagiscono quattro filamenti di DNA. Queste giunzioni si risolvono e le lacune si riparano, facilitando l'inserimento del gene bersaglio.
Preparare una piastra da 24 pozzetti contenente 500 microlitri di terreno di coltura completo senza antibiotici in ogni pozzetto. Preriscaldare la piastra in un incubatore umidificato a 37 gradi al 5% di anidride carbonica. Accendere il sistema di elettroporazione. Parametri di elettroporazione in ingresso per celle JURKAT o RAW.
Preparare la miscela cellula-DNA per l'elettroporazione. Raccogli la coltura cellulare JURKAT in un pallone da 25 centimetri quadrati. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 50 mL. Quindi, pellettare le celle mediante centrifugazione a 90 x g per otto minuti a temperatura ambiente.
Per quanto riguarda i surnatanti, per il lavaggio, risospendere le cellule con 5 mL di DPBS. Quindi, centrifugare la sospensione cellulare utilizzando le stesse condizioni del passaggio precedente. Rimuovere il DPBS e risospendere il pellet cellulare utilizzando 2 ml di DPBS. Utilizzare 10 microlitri di sospensione cellulare e mescolare con un volume uguale di blu di tripano allo 0,2%.
Per stimare il numero di cellule, caricare il campione in questo vetrino di conteggio. Inserire il diapositive di conteggio nel contatore automatico di celle e visualizzare l'immagine delle celle, quindi ottenere un risultato del conteggio delle celle. Calcola 2 milioni di celle per 5 ripetizioni di elettroporazione, per ogni esperimento knock-in.
Trasferire il numero richiesto di cellule in una provetta da centrifuga da 1,5 ml. Celle a pellet per centrifugazione. Per risparmiare tempo, è possibile preparare una miscela di elettroporazione durante la fase di centrifugazione. Aggiungere 2,5 microgrammi di ciascun vettore CRISPR-Cas9, 2,4 microgrammi di vettore di puntamento linearizzato e il tampone R di risospensione, per un volume totale di 55 microlitri, in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 mL.
Vorticare delicatamente e girare brevemente per mescolare bene. Lasciare la miscela di elettroporazione a temperatura ambiente prima dell'uso. Dopo la centrifuga, aspirare il DPBS, quindi centrifugare per altri 30 secondi. Rimuovere quanto più surnatante possibile. Risospendere le celle aggiungendo la miscela di elettroporazione preparata. Pipettare delicatamente su e giù.
Elettroporazione: Per quanto riguarda la miscela di elettroporazione cellulare, utilizzare un puntale di nucleofecazione da 10 microlitri con pipetta.
Importante: evitare la formazione di bolle d'aria durante il pipettaggio, che causerà un errore di elettroporazione. Premi "Avvia".
Dopo l'elettroporazione, trasferire il campione in un pozzetto di piastre a 24 pozzetti con terreno di crescita preriscaldato. Eseguire le stesse procedure di elettroporazione di cui sopra, sui restanti 4 campioni replicati. Scuotere delicatamente la piastra per garantire una distribuzione uniforme delle cellule. Incubare le cellule in un incubatore a 37 gradi per 48-72 ore prima della selezione delle cellule FACS.