Silenziamento genico basato sull'interferenza CRISPR: una tecnica per la repressione mirata della funzione genica nella leptospira patogena

L'interferenza CRISPR o CRISPRi, utilizza una variante disattivata di Cas9, dCas9, per il silenziamento genico mirato, che reprime la funzione genica.

Per eseguire CRISPRi, utilizzare un costrutto vettore navetta, un plasmide contenente origini di replicazione corrispondenti sia ai batteri E. coli che a quelli Leptospira, facilitando la propagazione in entrambe le specie.

Il vettore contiene anche una sequenza specifica per il gene dCas9 e un RNA a guida singola o sgRNA, per riconoscere la sequenza bersaglio.

Inizialmente, il vettore navetta è presente all'interno del donatore E. coli. Integrare la coltura di E. coli del donatore con l'ospite Leptospira per facilitare la coniugazione. La coniugazione stabilisce un contatto diretto da cellula a cellula tra gli organismi, facilitando l'assorbimento del plasmide navetta da parte di Leptospira. All'interno della cellula, il costrutto plasmidico produce sequenze di sgRNA ed esprime le proteine dCas9.

L'sgRNA contiene una regione protospaziatrice che riconosce la sua regione bersaglio complementare sul DNA di Leptospira, vicino al motivo adiacente al protospaziatore o PAM - una breve sequenza di riconoscimento sul DNA ospite. Questo aiuta dCas9 a formare un complesso con l'sgRNA nel sito bersaglio a valle del sito di inizio della trascrizione genica.

dCas9 del complesso sgRNA-dCas9 non ha l'attività catalitica per scindere i filamenti di DNA, ma agisce come barriera fisica per il movimento dell'enzima RNA polimerasi che forma l'mRNA, inibendo infine la trascrizione genica. Utilizzare la Leptospira geneticamente silenziata per ulteriori test.

Per la coniugazione, le cellule di Leptospira vengono coltivate a 29 o 37 gradi Celsius in terreni HAN. Un giorno prima della coniugazione, le cellule di E. coli del donatore vengono coltivate in terreno LB integrato con acido diaminopimelico - DAP e spectinomicina.

Successivamente, nel giorno della coniugazione, coltivare le colture sature di E. coli in LB più DAP. All'interno di una cappa di biosicurezza, assemblare l'apparato di filtrazione posizionando il filtro a membrana sopra la base di vetro, seguito da un imbuto di vetro da 15 ml. Entrambi i pezzi sono tenuti insieme dal morsetto a molla. Quindi, collegare il vetro a una pompa a vuoto. Aggiungere 5 ml di colture di Leptospira all'imbuto.

Successivamente, aggiungere il ceppo β163 di E. coli contenente il plasmide di interesse. Il volume varierà in base alla densità ottica della coltura. Puntiamo a una proporzione di celle 1:1. Ruotare la pompa del vuoto. Ora, i liquidi passeranno attraverso la membrana e le cellule saranno concentrate sopra di essa.

Prendi il filtro e posizionalo sulla piastra EMJH più DAP, con il lato batterico rivolto verso l'alto. Incubare le piastre a 29 gradi Celsius per 24 ore. Quindi, recuperare i filtri dalle piastre e metterli in una provetta conica da 50 mL.

Utilizzare 1 mL di terreno HAN liquido per recuperare le cellule dal filtro mediante pipettaggio. Visualizzare le cellule recuperate mediante microscopia in campo oscuro.

In questa fase, si possono osservare numeri equivalenti di E. coli e Leptospiri. Da 100 a 200 microlitri vengono utilizzati per diffondere i batteri su due piastre HAN contenenti spectinomicina. In questa fase, il DAP viene omesso ed E. coli non crescerà. Le piastre vengono incubate a 37 gradi Celsius e al 3% di CO₂. Le colonie dovrebbero essere evidenti tra 8 e 10 giorni.