JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:27 min. • July 8th, 2025
Il sistema tetraciclina-On o Tet-On è un sistema di espressione genica condizionale che attiva l'espressione del gene di interesse in presenza di tetraciclina o del suo analogo, la doxiciclina.
Iniziare con un topo geneticamente modificato con un genoma modificato contenente un gene che codifica per la proteina attivatrice trascrizionale controllata da tetraciclina inversa, o rtTA, guidata da un promotore specifico del fegato nelle cellule epatiche o negli epatociti. Inoltre, il topo contiene un gene di interesse sotto il controllo dell'operatore della tetraciclina o sequenze di tetO situate a monte e fuse selettivamente in un promotore minimo. Il tetO e il promotore sono chiamati elemento responsivo alla tetraciclina, o TRE.
L'rtTA espresso - una proteina di fusione che comprende il repressore tet, il tetR e il dominio di transattivazione VP16 della proteina virale - forma dimeri, che sono inattivi e non possono legarsi alla sequenza tetO del TRE, impedendo l'attivazione dell'espressione genica bersaglio.
Preparare una soluzione contenente doxiciclina e saccarosio. L'aggiunta di saccarosio aumenta l'appetibilità. Dopo il filtraggio, fornire al topo la soluzione di doxiciclina-saccarosio come acqua potabile. La doxiciclina somministrata si accumula nel fegato.
Negli epatociti, la doxiciclina si lega all'rtTA, causando un cambiamento conformazionale e un aumento dell'affinità per il sito di legame del DNA tetO. Il dominio di legame al DNA tetR di rtTA legato alla doxiciclina si lega alla sequenza tetO dell'elemento TRE. Il dominio VP16 recluta ulteriormente l'RNA polimerasi, portando alla trascrizione, alla formazione dell'mRNA e alla successiva espressione del gene bersaglio reporter a valle.
Per esperimenti di durata inferiore a 10 giorni, somministrare continuamente doxiciclina tramite acqua potabile utilizzando il seguente protocollo. Per prima cosa, sciogliere 5 grammi di saccarosio in 100 millilitri di acqua del rubinetto e sterilizzare in autoclave.
Quindi, sciogliere 100 milligrammi di doxiciclina-iclato in 5 millilitri di soluzione di saccarosio in un tubo conico da 15 millilitri. Successivamente, utilizzare una siringa da 10 millilitri per filtrare sterile la soluzione attraverso un filtro da 0,2 micron, quindi aggiungere la soluzione di doxiciclina filtrata ai restanti 95 millilitri di soluzione di saccarosio e fornire la soluzione al topo invece di bere acqua. Controllare quotidianamente e sostituire immediatamente se la soluzione diventa torbida in quanto ciò indica una proliferazione batterica eccessiva.