JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 4:34 min • July 8th, 2025
Per la trasfezione inversa di piccoli RNA interferenti, o siRNA, una classe di RNA a doppio filamento, in adipociti non aderenti o cellule adipose, preparare una sospensione di siRNA che ha come bersaglio uno specifico gene codificante una proteina negli adipociti. Aggiungere un reagente di trasfezione cationico adatto a base di lipidi. Incubare la miscela per formare complessi di trasfezione attraverso interazioni elettrostatiche.
Trasferire la miscela nei pozzetti rivestiti di collagene di una piastra a più pozzetti. I complessi di trasfezione si immobilizzano sul rivestimento della piastra mediante interazioni non specifiche. Pipettare una sospensione di adipociti in pozzetti contenenti complessi di trasfezione immobilizzati. Gli adipociti aderiscono liberamente al rivestimento della piastra, aumentando il contatto fisico tra le cellule e i complessi.
Il complesso di trasfezione si fonde con la membrana cellulare e trasporta il siRNA nel citoplasma. Il siRNA, che comprende un filamento antisenso con una sequenza complementare per colpire l'mRNA e un filamento senso, è riconosciuto dal complesso di silenziamento multiproteico che induce l'RNA, o RISC. Il siRNA si lega al RISC e i filamenti si separano, con il filamento antisenso che rimane legato al complesso.
Il complesso siRNA-RISC attivato riconosce e si lega ai siti complementari sull'mRNA bersaglio. Ciò porta alla scissione sequenziale-specifica dell'mRNA da parte della proteina argonauta del complesso RISC. L'mRNA tagliato viene ulteriormente degradato dal macchinario cellulare, silenziando così l'espressione genica bersaglio.
Pipettare il siRNA con un terreno minimo essenziale migliorato da miscelare e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere il reagente di trasfezione e il terreno minimo essenziale migliorato al siRNA e pipettare per miscelare. Incubarlo per 20 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere la miscela di trasfezione a ciascun pozzetto della piastra rivestita di collagene.
Lavare due volte le cellule nella piastra di Petri da 100 millimetri con DPBS. Aggiungere 5 volte la tripsina alle cellule, assicurandosi di coprire l'intera superficie con la tripsina. Attendere 30 secondi e rimuovere con cura la tripsina. Incubare la capsula di Petri per 5-10 minuti a 37 °C nell'incubatore.
Quindi, tocca la parabola per staccare le cellule, evitando danni alle cellule. Aggiungere 10 millilitri di DMEM senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% di FCS e 1% di penicillina e streptomicina, per neutralizzare la tripsina. Pipettare con cura il terreno verso l'alto e verso il basso per staccare le cellule e omogeneizzare la sospensione cellulare.
Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio Malassez o un contatore di cellule automatizzato e regolare la concentrazione delle cellule a 6,25 x 105 cellule/mL di terreno. Seminare 800 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti o 400 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente la miscela di trasfezione.
Incubare le piastre in un incubatore per colture cellulari e non disturbarle per 24 ore. Il giorno successivo, sostituire con cura il surnatante con DMEM fresco senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% di FCS e 1% di penicillina e streptomicina e rimettere le cellule nell'incubatore.