Editing genico mediato da morfolino: una tecnica di knockdown genico che utilizza oligonucleotidi morfolini bloccanti traduzionali in uova di pesci delle caverne unicellulari

I morfolini sono oligonucleotidi corti, ridisegnati a filamento singolo, con differenze nella loro struttura di fosfato e zucchero rispetto ai nucleotidi naturali. Queste caratteristiche migliorano la stabilità dei morfolini al pH fisiologico. Nonostante queste variazioni, i morfolini contengono le basi nucleotiche standard, che aiutano a progettare oligonucleotidi complementari alla specifica sequenza di mRNA da un gene bersaglio desiderato da abbattere.

Per eseguire l'editing genetico guidato dalla morfolino, iniziare prelevando uova di pesce delle caverne unicellulari posizionate all'interno dei pozzetti di una piastra di iniezione di agarosio. Visualizza le uova traslucide e rotonde per individuare il sacco vitellino, una struttura piena di liquido presente all'interno dell'uovo.

Prenda un ago per microiniezione preriempito con una soluzione contenente morfolini progettati. Iniettare la soluzione direttamente nel tuorlo d'uovo, assicurandosi che i morfolini entrino nel citoplasma cellulare. All'interno delle cellule, il gene bersaglio forma l'mRNA, che viene trasportato nel citoplasma.

All'interno del citoplasma, il morfolino iniettato si ibrida con il suo trascritto di mRNA bersaglio complementare nel sito di inizio endogeno e si estende oltre di esso. Questo processo blocca il legame della subunità più grande del ribosoma con il nascente complesso di inizio della traduzione costituito da piccole subunità ribosomiali complessate con alcune proteine specifiche.

Successivamente, la progressione del complesso di inizio della traduzione viene ostacolata stericamente, il che interrompe la traduzione dell'mRNA nella proteina. Infine, la concentrazione della proteina bersaglio si riduce a causa del blocco traduzionale da parte dei morfolini.

Il giorno dell'iniezione, utilizzare una pipetta di vetro per trasferire gli ovuli unicellulari nella piastra di iniezione, riempiendo fino a cinque file della piastra di iniezione con 30-40 uova per fila. Mantieni le uova idratate con una piccola quantità di acqua del sistema dei pesci. Scongelare il morfolino con ghiaccio e preparare la soluzione iniettabile in modo da iniettare 400 picogrammi di morfolino per uovo, utilizzando una punta lunga della pipetta Microloader o aggiungendo un bolo da 2 a 4 microlitri alla fine.

Quando tutti gli aghi sono stati caricati, utilizzare una pinza per tagliare la lunghezza in eccesso dalle punte dell'ago per iniezione e montare il primo ago in un micromanipolatore collegato a un microiniettore picolitro. Quindi, posizionare la piastra di iniezione sotto un microscopio da dissezione e utilizzare il micromanipolatore per penetrare ogni uovo con l'ago, prima di iniettare 1 nanolitro di soluzione per iniezione di morfolino direttamente nel tuorlo.