JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 5:40 min • July 8th, 2025
Inizia con embrioni vitali di pesce zebra in uno stadio cellulare posti nei pozzetti di uno stampo per microiniezione.
Caricare un ago per microiniezione con una soluzione contenente l'mRNA codificante la trasposasi Tol2 e plasmidi donatori trasposoni. I plasmidi comprendono un promotore ubiquitario del pesce zebra e un gene codificante una proteina fluorescente affiancato da bracci di trasposone Tol2.
Iniettare con cautela la soluzione di microiniezione nel citoplasma dell'embrione di zebrafish. All'interno della cellula, gli mRNA della trasposizione di Tol2 si traducono in proteine della trasposasi di Tol2 e vengono trasportati attivamente nel nucleo.
I siti Tol2 sul plasmide donatore comprendono specifiche ripetizioni terminali invertite, o ITR, che fiancheggiano il gene reporter. Gli ITR sono affiancati da brevi ripetizioni dirette. Le proteine della trasposasi riconoscono e si legano ai siti ITR, formando una forcina sul DNA fiancheggiante. Le trasposioni scindono ulteriormente il costrutto del trasposone dal DNA fiancheggiante, liberandolo dal plasmide e lasciando dietro di sé brevi ripetizioni dirette.
Le trasposisi creano una rottura sfalsata a doppio filamento nel genoma della cellula somatica e inseriscono il costrutto del trasposone nel sito del genoma. Il riempimento delle estremità sfalsate mediante DNA polimerasi seguito dalla legatura delle tacche crea brevi ripetizioni dirette.
La legatura provoca un'integrazione stabile del costrutto del trasposone nel genoma della cellula somatica e il promotore facilita l'espressione della proteina fluorescente. Incubare gli embrioni iniettati. Durante lo sviluppo embrionale, le cellule somatiche danno origine a diversi tipi di cellule e creano pesce zebra transgenico.
Dopo aver preparato l'mRNA della trasposasi Tol2 e la soluzione per iniezione, secondo il protocollo di testo, il pomeriggio prima dell'iniezione, sono state allestite da quattro a sei vasche di riproduzione con almeno due maschi e due femmine. Per ridurre la quantità di rifiuti ittici e indurre una risposta riproduttiva, evitare di nutrire i pesci nel pomeriggio.
La mattina seguente, rimuovere la soluzione per iniezione preparata dal congelatore a 80 gradi Celsius negativi e metterla sul ghiaccio. Tirare i divisori nelle vasche di riproduzione dei pesci e permettere ai pesci di accoppiarsi. In generale, i pesci depongono le uova entro 20-30 minuti.
Durante l'attesa, utilizzando un estrattore per micropipette con i seguenti parametri, estrarre gli aghi dal vetro capillare. Usa una salvietta da laboratorio per rompere l'estremità dell'ago e creare un bordo smussato. Un diametro più piccolo è preferibile per ridurre la mortalità embrionale.
Una volta che i pesci hanno deposto le uova, raccoglietele in una capsula Petri di 10 centimetri di diametro. Immediatamente sotto il microscopio di dissezione, rimuovere tutti gli embrioni anomali e i rifiuti di pesce. Quindi, pipettare gli embrioni fecondati in uno stampo per iniezione di agarosio al 3% preparato. Rimuovi l'acqua in eccesso per aiutare a mantenere gli embrioni in posizione.
Una volta che tutte le file sono riempite con embrioni vitali, disponili in modo che le singole cellule siano tutte orientate con un angolo di 45 gradi orizzontalmente rispetto all'ago. Questo renderà l'iniezione molto più facile in seguito. Quindi, indossando i guanti, utilizzare un puntale per pipetta di caricamento da 20 microlitri per rimuovere 5 microlitri del costrutto preparato dal tubo sul ghiaccio.
Inserire con cautela la punta della pipetta nell'estremità posteriore del tubo capillare rotto fino al punto in cui inizia a assottigliarsi, per avvicinare il più possibile il reagente alla punta ed espellerlo nel capillare. Se ci sono ancora bolle d'aria, scuotere l'ago, facendo attenzione a non rompere la punta.
Inserire l'ago direttamente nel supporto dell'ago per microiniezione e serrare accuratamente fino a quando l'ago rimane in posizione, quindi regolare l'angolo a circa 45 gradi. Una volta preparato e fissato l'ago, accendere il microscopio e il serbatoio a pressione del gas. Regolare il volume di iniezione utilizzando circa 0,5 PSI per la presa e 30 PSI per l'espulsione.
Verificare che la soluzione fuoriesca dall'ago quando si preme il pedale. Utilizzando un micrometro da tavolino con una goccia di olio minerale, regolare il volume e il flusso della soluzione a circa 10 micrometri di diametro. Assicurarsi che la contropressione consenta a una piccola quantità di soluzione di gocciolare dall'ago.
Se non c'è abbastanza contropressione, l'azione capillare farà sì che il liquido entri nell'ago e distrugga l'mRNA. Una volta calibrato l'ago, inserirlo nella singola cellula degli embrioni fecondati utilizzando il bordo della tacca di gel per fornire un supporto che mantenga l'embrione in posizione e consenta all'ago di applicare pressione senza spostare l'embrione.
Una volta che la punta dell'ago si trova nella singola cellula, premere il pedale per rilasciare la quantità di soluzione desiderata. È importante iniettare la soluzione nella cellula, non il tuorlo per generare il pesce zebra transgenico. Ripeti questo processo per tutti gli embrioni.
Al termine, utilizzare una pipetta di trasferimento usa e getta da 3,4 millilitri e l'acqua del sistema per pesci per trasferire gli embrioni iniettati in un piatto etichettato sciacquandoli dalla tacca dell'agarosio. Conserva gli embrioni in un'incubatrice a 28,5 gradi Celsius per farli sviluppare.