Knockout genico multiplo mediato da concatemero CRISPR: una tecnica per eliminare simultaneamente più geni mediante un percorso di giunzione terminale non omologo nelle cellule intestinali di topo

Per eliminare simultaneamente più geni utilizzando il sistema CRISPR-concatemer-Cas9, iniziare con un tubo contenente la sospensione cellulare intestinale di topo. Integrare la provetta con vettori concamero CRISPR contenenti la cassetta di espressione per RNA guida multipli, o gRNA, integrati adiacenti l'uno all'altro.

Ogni cassetta di gRNA è progettata su misura per eliminare individualmente il gene desiderato. Aggiungere vettori di espressione che codificano per l'endonucleasi Cas9 alla stessa provetta. Elettroporare la miscela cellula-plasmide - una tecnica che utilizza la corrente elettrica per facilitare l'ingresso dei plasmidi nella cellula. All'interno della cellula, la co-espressione del concatemero CRISPR e del vettore Cas9 forma sequenze di gRNA e nucleasi Cas9, rispettivamente.

Ogni sequenza di gRNA si lega al corrispondente enzima Cas9, formando più complessi Cas9-gRNA che si attaccano ai siti bersaglio nel genoma ospite. Questo legame attiva l'enzima Cas9, che produce un intaccamento in entrambi i filamenti di DNA a monte del motivo adiacente al protospaziatore, o sito PAM. Ciò si traduce in una rottura a doppio filamento, o DSB, nel DNA bersaglio.

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