JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:11 min. • July 8th, 2025
Il virus adeno-associato ricombinante, rAAV, è un piccolo virus a DNA a filamento singolo geneticamente modificato per colpire un tipo di cellula specifico e trasportare il suo carico genetico al nucleo della cellula ospite per l'espressione genica.
Inizia trattenendo un cucciolo di topo crio-anestetizzato. Sterilizzare la pelle posteriore e iniettare per via sottocutanea il vettore rAAV che trasporta il transgene desiderato lungo un promotore cardiaco-specifico. Il vettore viene assorbito nel sistema vascolare e raggiunge organi distanti, compreso il cuore.
Qui, il virus ricombinante si attacca alla superficie del cardiomiocita e viene internalizzato tramite endocitosi in un endosoma. All'interno dell'endosoma, il capside virale si disassembla parzialmente, esponendo le proteine litiche virali. Questa proteina induce pori nella membrana endosomiale, attraverso i quali il vettore fuoriesce nel citoplasma.
Il vettore viaggia attraverso i microtubuli citoplasmatici ed entra attraverso il poro nucleare. Una volta nel nucleo, il capside virale si disassembla per rilasciare il suo genoma. Il DNA a singolo filamento che trasporta il gene bersaglio viene quindi convertito in DNA a doppio filamento.
Dopo la trascrizione del DNA, l'mRNA prodotto si sposta nel citoplasma. Qui, l'mRNA subisce una traduzione, esprimendo la proteina bersaglio nei cardiomiociti. Osservare campioni di tessuto provenienti da diversi organi al microscopio a fluorescenza per determinare l'efficienza e la specificità tissutale della consegna genica al cuore.
Dopo aver determinato il titolo virale secondo il protocollo di testo, preparare le soluzioni di lavoro rAAV9 con titoli virali di 1-7 x 1012 particelle per millilitro. Per trattare i topi neonati, utilizzare la soluzione rAAV9 per preriempire una siringa da insulina da 0,33 x 12,7 millilitri con un ago da 1/2 pollice calibro 29, evitando bolle d'aria.
Dopo aver crioanestetizzato un cucciolo, tienilo in una mano con il pollice e l'indice. Quindi, strofina la pelle posteriore del cucciolo con un bastoncino di tampone imbevuto di alcol isopropilico al 70%. Inserire l'ago della siringa nel sottocute antero-dorsale dell'animale con un angolo compreso tra 5 e 10 gradi prima di iniettare da 50 a 70 microlitri della soluzione di rAAV9.