JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 2:15 min • July 8th, 2025
Le nanolame sono particelle sintetiche simili a virus prive del materiale genetico virale incapsulato, il che le rende vettori adatti per il carico straniero nelle cellule ospiti. Queste nanolame sono costruite utilizzando il nucleo retrovirale del virus della leucemia di topo circondato dalla membrana a doppio strato lipidico derivata dalle cellule produttrici eucariotiche utilizzate per assemblare le nanolame in vitro.
Il nucleo contiene l'enzima Cas9 complessato con l'sgRNA specifico per la sequenza del genoma bersaglio. Le proteine del nucleo sono circondate dalle proteine dell'involucro che contengono un dominio transmembrana o TM che passa attraverso il doppio strato lipidico. La TM si lega a un dominio superficiale glicoproteico extracellulare o SU che sporge dal rivestimento a doppio strato.
Per utilizzare le nanolame per l'editing genetico, prendere una coltura di cellule bersaglio aderenti e integrarla con la soluzione nanoblade. Nella coltura, l'SU sporgente di una nanolama riconosce il recettore corrispondente sulla superficie della cellula ospite e si lega ad esso. Ciò porta a modifiche nella struttura del dominio SU, facilitandone il rilascio.
Questi cambiamenti innescano i cambiamenti conformazionali nel dominio TM, che poi si lega alla membrana ospite. Questo legame porta la nanolama vicino alla cellula ospite, consentendo la fusione della membrana a doppio strato virale con la membrana ospite, e il nucleo virale si sposta nel citoplasma.
Una volta all'interno della cellula, il nucleo si disintegra, rilasciando il complesso Cas9-sgRNA che può eseguire l'editing del genoma nel suo sito bersaglio.
Per la trasduzione delle cellule bersaglio con nanolame, sostituire il terreno di coltura cellulare con 500 microlitri del terreno contenente nanolame purificate. Dopo quattro-sei ore di incubazione cellulare, sostituire il terreno con la normale quantità di terreno fresco.