JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:48 min • July 8th, 2025
Per eseguire il trasferimento genico idrodinamico, iniziare prendendo una siringa riempita con una soluzione a base salina contenente plasmidi ricombinanti che trasportano il gene di interesse. Successivamente, prendere un modello murino e iniettare rapidamente un grande volume di soluzione plasmidica alla base della coda, assicurandosi che la soluzione plasmidica venga iniettata per via endovenosa nella vena della coda.
L'iniezione pressurizzata di un alto volume di plasmidi genera una forza meccanica chiamata forza idrodinamica, che aumenta la pressione intravascolare nella vena cava inferiore, una vena che trasporta il sangue deossigenato al cuore.
Un grande volume di liquido induce congestione nel ventricolo destro del cuore, costringendo l'inversione nella direzione del sangue. Questo passaggio costringe la soluzione plasmidica ad entrare nella vena epatica, che la trasporta al fegato.
I plasmidi si muovono all'interno dei sinusoidi epatici, gli spazi del fegato rivestiti dalle cellule endoteliali. L'aumento del volume del sangue aiuta i plasmidi a permeabilizzare lo strato endoteliale, aiutandoli a raggiungere gli epatociti circostanti, le cellule del fegato.
Il rapido afflusso di soluzione plasmidica induce una pressione sulla membrana cellulare degli epatociti, generando pori transitori. Questi pori facilitano l'assorbimento del DNA plasmidico da parte delle cellule. Successivamente, i pori della membrana si chiudono, intrappolando i plasmidi all'interno degli epatociti.
L'espressione riuscita del gene di interesse negli epatociti conferma la trasfezione.
Inizia pesando i topi, quindi prepara una soluzione salina sterile contenente 15 microgrammi per millilitro di costrutto vettore della bella addormentata senza soluzione salina senza endotossine e 1 microgrammo per millilitro di pc-HSB5 privo di endotossine. Preparare una quantità sufficiente di soluzione per iniettare in ciascun topo un volume pari al 10% del suo peso corporeo. Riempi una siringa sterile da 3 millilitri con il volume richiesto per un topo e inserisci un ago calibro 27.
Dopo aver aggiunto una quantità adeguata di carta velina per lasciare uno spazio minimo per il movimento, ma sufficiente per la respirazione, inserire il mouse in un apposito sistema di ritenuta con fori per la respirazione. Riscalda la coda usando una lampada a infrarossi per 30-60 secondi, osservando attentamente i segni di surriscaldamento, come un rapido movimento della coda o altri segni di agitazione, quindi pulisci la coda con un tampone imbevuto di alcol.
Inserisci l'ago quasi orizzontalmente in una delle due vene laterali della coda vicino alla base della coda. Se posizionato correttamente, una piccola quantità di sangue potrebbe rifluire nel cono dell'ago. Iniettare il volume totale nella vena caudale entro 8-10 secondi. Dopo l'iniezione, rimuovere immediatamente il mouse dal sistema di contenzione. Comprimere la ferita da iniezione con una garza sterile per almeno 30 secondi o fino a quando l'eventuale sanguinamento non si attenua.
Il successo dell'iniezione idrodinamica della vena caudale è fondamentale per la trasfezione e dipende in particolare dalla velocità, dal volume e dal tempo di iniezione. Per facilitare l'iniezione endovenosa, assicurati che i topi non siano stressati o disidratati il giorno dell'iniezione.
Dopo 30-60 minuti di stabulazione da solo in una gabbia di recupero, trasferisci il topo nella sua gabbia originale.