Trasformazione genetica mediata da Agrobacterium: un metodo per trasformare geneticamente il genoma del riso tramite Agrobacterium tumefaciens geneticamente modificato

L'Agrobacterium tumefaciens, un batterio patogeno per le piante, può essere geneticamente modificato introducendo un plasmide Ti preparato artificialmente, che trasporta un gene di interesse nel suo DNA di trasferimento o nella regione del T-DNA, e un plasmide helper che trasporta i geni di virulenza o Vir per il trasferimento del T-DNA nelle cellule vegetali.

Per la trasformazione genetica mediata da Agrobacterium, inizia con una giovane infiorescenza di riso e tagliala a pezzetti. Trasferire le talee in un terreno di coltura e incubare per facilitare la crescita delle talee in una massa cellulare indifferenziata chiamata callo.

Ora, trasferire il callo in un mezzo di infiltrazione dell'Agrobacterium contenente acetosiringone, un chemioattrattivo per l'Agrobacterium. Successivamente, aggiungi una coltura di Agrobacterium geneticamente modificato al terreno e incuba brevemente.

Le molecole di acetosiringone attivano la proteina del recettore cellulare - VirA - sulla membrana dell'Agrobacterium, che media ulteriormente la fosforilazione di una proteina attivatrice trascrizionale - VirG. La VirG fosforilata si muove verso il plasmide helper e attiva la trascrizione di una cascata di geni di virulenza, tra cui le proteine canale e le endonucleasi - VirD1 e VirD2.

Le proteine canale formano un canale di trasporto che collega la cellula batterica e quella vegetale, mentre le endonucleasi si legano alle sequenze di confine nel plasmide Ti e scindono il T-DNA con VirD2, legato a un'estremità. Successivamente, VirD2 dirige l'ingresso del T-DNA attraverso il canale di trasporto nelle cellule del callo e ne facilita l'integrazione nel genoma del riso.

Pulisci ogni infiorescenza con un tampone imbevuto di alcol al 70% e lascialo asciugare prima di tagliare. Porta l'infiorescenza su un banco da laboratorio sterile e tagliala a pezzetti con delle forbici sterilizzate. Quindi, trasferire le talee su una piastra di Petri contenente terreno NBD2.

Incubare la piastra al buio a 26 gradi Celsius, per 10-14 giorni per indurre il callo. Per eseguire la trasformazione, trasferire una singola colonia dalla piastra YEB con antibiotici selettivi a 5 millilitri di terreno YEB liquido contenente gli stessi antibiotici, in una provetta sterile conica da 50 millilitri. Agitare la provetta su un agitatore orbitale a 250 x g e da 25 a 28 gradi Celsius fino a quando i batteri crescono fino a un OD₆₀₀ di 0,5.

Aggiungere 1 millilitro di sospensione batterica a 100 millilitri di terreno YEB con gli stessi antibiotici selettivi, in un pallone conico da 250 millilitri, e agitare il pallone su un agitatore orbitale a 250 x g e 28 gradi Celsius per quattro ore. Centrifugare la coltura a 4.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente, per raccogliere i batteri. Scartare il surnatante e risospendere il pellet con un mezzo AAM-AS e diluire la sospensione a OD₆₀₀ di 0,4.

Dopo l'incubazione, raccogliere circa 150 calli embriogenici sani, di colore giallo chiaro, in un pallone sterile da 150 millilitri. Aggiungere da 50 a 75 millilitri di sospensione cellulare batterica nel pallone, quindi aggiungere da 10 a 25 millilitri di terreno AAM-AS fresco, per immergere i calli per 10-20 minuti, agitando di tanto in tanto.

Versare accuratamente la sospensione batterica dal pallone e asciugare le calli con carta da filtro sterile. Quindi, posizionarli su una piastra di Petri con NBD-AS e coprirli con carta da filtro. Incubare le calli a 25-28 gradi Celsius al buio per tre giorni, controllando la proliferazione batterica.

Dopo tre giorni di co-coltivazione, trasferire le calli in una capsula di Petri sterile utilizzando carta da filtro, quindi asciugarle all'aria per due ore su un banco pulito. Assicurarsi che i calli non aderiscano alla carta da filtro e trasferirli nel mezzo di selezione primario NBD2.

Dopo due settimane, trasferire uniformemente i calli in un nuovo piatto contenente un terreno di selezione fresco. Quindi, spostare i calli in terreno SM fresco per la differenziazione e i germogli in terreno MS (con 10 mg/L di igromicina) per far proliferare più germogli.