JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:59 min • July 8th, 2025
Per la somministrazione di DNA plasmidico basata sull'elettroporazione nelle cellule neuronali primarie, iniziare con una sospensione di cellule in un terreno di elettroporazione adatto. Aggiungere il DNA plasmidico codificante una proteina fluorescente per preparare la miscela di elettroporazione.
Trasferire delicatamente la miscela per elettroporazione in una cuvetta per elettroporazione, evitando bolle d'aria che potrebbero influire negativamente sull'efficienza dell'elettroporazione. Trasferire la cuvetta nel supporto della cuvetta dell'elettroportatore; Impostare i parametri di elettroporazione. Avviare l'elettroporazione.
I brevi impulsi elettrici ad alta tensione applicati attraverso la membrana cellulare causano l'accumulo di carica differenziale su entrambi i lati della membrana, aumentando il potenziale transmembrana, la tensione attraverso la membrana cellulare.
Quando il potenziale transmembrana indotto supera il potenziale di rottura del doppio strato lipidico, il doppio strato lipidico si destabilizza con il cambiamento di configurazione localizzato, formando pori idrofili transitori sulla membrana cellulare. I pori di dimensioni adeguate forniscono un percorso per il DNA plasmidico per entrare nel citoplasma cellulare.
Al termine dell'elettroporazione, il doppio strato lipidico si richiude, ripristinando l'integrità del doppio strato della membrana cellulare, intrappolando così il DNA plasmidico. Inoltre, durante la fase del ciclo cellulare in cui la membrana nucleare, la membrana a doppio strato che circonda il nucleo, si disassembla, il DNA plasmidico trasloca nel nucleo.
Piastre elettroporate delle cellule in pozzetti contenenti terreni di una piastra multi-pozzetto con vetrini coprioggetti rivestiti di proteine. Incubare per consentire alle cellule di aderire al vetrino coprioggetti rivestito di proteine. Le cellule trasfettate con successo contenenti DNA plasmidico esprimono le proteine fluorescenti.
Per iniziare, aggiungere 0,5 millilitri di terreno di coltura in ciascuna parete della piastra di coltura a 24 pozzetti contenente vetrini coprioggetti rivestiti e mantenerla calda a 37 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica. Pipettare il numero necessario di cellule in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di Opti-MEM. Ripetere questa procedura due volte per assicurarsi che non siano presenti residui di terreno di coltura nella provetta. Impostare i parametri dell'elettroporazione come elencato. Pipettare delicatamente la reazione di elettroporazione per miscelarla bene e utilizzare una punta lunga per pipetta P200 per trasferire un volume esatto di 100 microlitri di miscela nella cuvetta con spazio di due millimetri.
Una volta che la cuvetta è all'interno della camera della cuvetta, premere il pulsante omega dell'elettroporatore e annotare il valore di impedenza aderendo a un volume preciso di 100 microlitri. L'intervallo dei valori di impedenza dovrebbe essere di circa 30 e 35.
Premere il pulsante Start per avviare l'impulso. Registrare i valori di corrente misurati e i gioielli mostrati sul riquadro di lettura. Rimuovere la cuvetta dalla camera.
Aggiungere immediatamente 100 microlitri di terreno di coltura preriscaldato nella cuvetta e risospenderla pipettandola su e giù due o tre volte. Trasferire immediatamente la sospensione cellulare sulla piastra a 24 pozzetti precedentemente preparata. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica.