Nucleofection of Parameter Forms: un metodo di trasfezione basato sull'elettroporazione per fornire plasmidi codificanti proteine fluorescenti nel nucleo di sporozoite

Per fornire plasmidi nei nuclei di sporozoiti mediante nucleofezione, iniziare con una sospensione di sporozoiti isolati e vitali - stadio mobile e infettivo di parassiti - in tampone. Gli sporozoiti sono cellule di forma sottile racchiuse da una membrana plasmatica esterna e da un sottostante complesso di membrana interna costituito da una serie di vescicole appiattite e proteine fondamentali per la stabilità strutturale e la motilità.

Centrifugare la sospensione per pellettizzare gli sporozoiti. Risospendere il pellet di sporozoite in un volume adeguato di tampone di trasfezione nucleare, integrato con plasmidi codificanti proteine fluorescenti. Il tampone di trasfezione nucleare con elevata capacità tampone e forza ionica garantisce una trasfezione efficiente preservando la funzionalità dello sporozoite.

Trasferire la sospensione in una cuvetta a trasfezione nucleare. Posizionare la cuvetta nel supporto di un dispositivo di nucleofezione. Eseguire il programma di nucleofezione appropriato.

Durante la nucleofezione, impulsi brevi e ad alta tensione applicati in modo specifico, insieme ai costituenti tampone, interrompono temporaneamente la membrana plasmatica e il complesso della membrana interna, formando pori transmembrana, che forniscono ai plasmidi l'accesso al citoplasma.

Contemporaneamente, questi campi elettrici ad alta intensità disturbano anche la membrana nucleare a doppio strato che circonda il nucleo che sviluppa lacune transitorie, facilitando l'ingresso diretto dei plasmidi nel nucleo, senza bisogno di divisione cellulare.

Una volta completata la nucleofezione, i pori della membrana cellulare e nucleare si richiudono, ripristinando l'integrità e l'omeostasi della membrana e intrappolando i plasmidi all'interno del nucleo.

Rimuovere la cuvetta dal dispositivo. Aggiungere un terreno adatto per il recupero dello sporozoite e trasferire in una provetta nuova. Sporozoiti nucleofettati con successo con DNA plasmidico esprimono proteine fluorescenti.

Per prima cosa, centrifugare la sospensione di sporozoiti o merozoiti a 600 x g per 10 minuti, quindi scartare il surnatante. Nell'ordine seguente, aggiungere 85 microlitri di tampone di trasfezione nucleare, 10 microgrammi di plasmide e 25 unità di enzima di restrizione nella provetta da 1,5 millilitri contenente sporozoiti o merozoiti. Trasferire la sospensione in una tazza di trasfezione nucleare.

Inserire la tazza in una scanalatura di trasferimento nucleare, accendere il dispositivo di nucleofenzione utilizzando il pulsante di accensione e selezionare la procedura di trasfezione U-033. Al termine del programma, premere il pulsante X del dispositivo di nucleofezione e lo schermo visualizza OK, indicando che la nucleofezione è riuscita. Aggiungere da 0,5 a 1 millilitro di Dulbecco's Modified Eagle's Medium alla tazza di nucleofecazione per fermare la reazione.

Dopo aver mescolato delicatamente, trasferire la sospensione in un tubo da 1,5 millilitri.