JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:31 min. • July 8th, 2025
La somministrazione genica lentivirale assistita da laser è una tecnica per trasferire un transgene in un sistema ospite.
Per produrre topi transgenici, iniziare con uova fecondate di topo isolate in un terreno di coltura adatto. Posizionare la piastra di coltura contenente ovuli fecondati su un tavolino da microscopio preinstallato con un apparecchio laser e collegato a un software di controllo. Osservare con un ingrandimento adeguato.
Le uova fecondate sono circondate da zona pellucida, uno strato protettivo di glicoproteine che barriera le particelle lentivirali. Per permeare questa barriera, accendere l'apparecchio laser e assicurarsi che il LED del laser sia visibile sopra la zona pellucida. Utilizzando il software di controllo, sparare il laser. Regolare la durata della cottura in base al diametro di perforazione desiderato.
Metti le uova in un'incubatrice per il recupero. Dopo una breve incubazione, rimuovere le uova e aggiungere particelle di lentivirus che trasportano il gene di interesse e un marcatore fluorescente selezionabile.
Con la zona pellucida perforata, il lentivirus si diffonde facilmente verso la membrana della cellula uovo ed entra attraverso l'endocitosi. Il lentivirus si disassembla, rilasciando il suo RNA, che, quando viene elaborato in sequenza in un DNA a doppio filamento, entra nel nucleo ospite, integrando i geni estranei nel genoma ospite.
Incubare le uova e lasciarle sviluppare in blastocisti. Impiantare le blastocisti in topi femmina accoppiati. Una volta completata la gestazione, recupera i cuccioli e analizzali per la presenza di transgeni.
Mentre le uova sono nell'incubatrice, impostare e calibrare il laser XYClone secondo le raccomandazioni del produttore. Quando le uova sono pronte, posizionare la prima piastra a goccia sul tavolino del microscopio laser e mettere a fuoco manualmente la zona pellucida. Dopo aver confermato che la luce LED del laser è visibile attraverso l'obiettivo, spostare il tavolino del microscopio per mirare alla zona con il laser LED e utilizzare il software del computer per impostare il laser XYClone su 250 microsecondi.
Regola le dimensioni della luce LED alle dimensioni appropriate e perfora la zona pellucida di ciascun uovo tre volte con il laser per produrre tre fori da 10 micrometri.
È fondamentale eseguire la perforazione in modo rapido ma attento, poiché gli ovuli fecondati non possono rimanere fuori dall'incubatrice per più di 15 minuti.
Quindi, rimetti le uova perforate nell'incubatrice per altre due ore. Al termine della seconda incubazione, trattare la goccia di KSOM da 50 microlitri con 2 microlitri di lentivirus concentrato senza mescolare e rimettere le uova nell'incubatrice per quattro giorni. Quando gli ovuli si sono sviluppati in blastocisti, utilizzare un dispositivo di trasferimento embrionale non chirurgico per depositare circa 10-15 embrioni e circa 2 microlitri di KSOM.
17 giorni dopo il trasferimento dell'embrione, consentire alla topolina incinta di partorire naturalmente o raccogliere i neonati con taglio cesareo, se necessario.