JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 5:33 min. • July 8th, 2025
Iniziare con un volume ottimale di perle d'oro - veicoli di consegna genica biologicamente inerti e non tossici - in una provetta da microcentrifuga. Quindi, aggiungi agenti cationici - spermidina e cloruro di calcio, seguiti dai frammenti di DNA desiderati alle perle d'oro. Muovi delicatamente il tubo e incuba.
Il cloruro di calcio si lega ai frammenti di DNA e ne facilita il rivestimento sulle perle d'oro attraverso i residui di spermidina. Quindi, centrifugare e rimuovere il solvente. Risospendere le perle rivestite di DNA in etanolo. Pipettare delicatamente le perle su un disco macrocarrier sterile. Lasciate asciugare.
Impostare un apparato di pistola genica biolistica comprendente un tubo di accelerazione del gas elio e una camera di bombardamento con un disco di rottura e uno schermo di arresto nelle rispettive fessure. Quindi, capovolgere il disco portamacro e caricarlo sotto il disco di rottura.
Successivamente, posizionare le cellule ospiti bersaglio coltivate in un terreno solido adatto integrato con sorbitolo, uno stabilizzatore osmotico per migliorare l'efficienza della trasformazione. Una volta che la configurazione è pronta, spara con la pistola genetica.
Mentre l'elio viaggia lungo il tubo di accelerazione, la pressione continua ad aumentare fino a quando il disco di rottura si rompe, creando onde d'urto con elio. Queste onde d'urto spingono il disco portatore macro che trasporta le perle d'oro verso lo schermo di arresto, che consente solo il passaggio delle perle d'oro.
Le perle d'oro accelerate penetrano nel nucleo della cellula ospite, integrando il DNA desiderato nel genoma della cellula ospite.
Iniziare utilizzando una pinza per immergere i dischi biolistici macrocarrier arancioni in etanolo al 100%, quindi trasferire i dischi in una grande capsula di Petri contenente drierite, facendo attenzione che i dischi non tocchino l'essiccante. Una volta asciutti, premere i dischi in supporti per dischi d'argento puliti con etanolo, quindi far vorticare un tubo di perline d'oro e aliquotare 12 microlitri della soluzione di perline in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri per trasformazione.
Successivamente, aggiungere in sequenza 2 microgrammi di DNA, 10 microlitri di cloruro di calcio e due microlitri di base priva di spermidina in ciascun tubo di perline. Agitare ogni campione, quindi incubare le provette a temperatura ambiente per 5 minuti, con un leggero movimento occasionale per risospendere le perle depositate.
Al termine dell'incubazione, pellettare le perle d'oro rivestite di DNA e aspirare con cura il surnatante. Risospendere lentamente le perle completamente in 600 microlitri di etanolo al 100%, quindi pellettare nuovamente le cellule, questa volta risospendendo le perle in 8 microlitri di etanolo.
Ora erogare ogni tubo di perline al centro di un singolo disco biolistico in cerchi di 1 centimetro di diametro. Se è presente una concentrazione sufficiente di perline, una volta che le perline sono asciutte sarà visibile un cerchio d'oro al centro di ogni disco.
Per azionare la pistola genetica, per prima cosa, accendere la pompa del vuoto, quindi ruotare la manopola del serbatoio dell'elio in senso antiorario fino a raggiungere una pressione di circa 2200 PSI sul manometro. Quindi, gira l'interruttore rosso sinistro per accendere la pistola genetica e regola le portate per il vuoto e lo sfiato in modo che il vuoto raggiunga 28 pollici di mercurio entro 15 secondi. Verificare che la distanza tra il disco di rottura e il macrocarrier sia di circa 3/8 di pollice in questo momento.
Quando tutto è in posizione, pulire l'intera camera con etanolo al 70% e immergere i dischi di rottura in etanolo al 100%. Dopo aver asciugato i dischi su una superficie sterile, utilizzare una chiave dinamometrica per allentare il supporto del disco di rottura e inserire un disco pulito. Riavvitare il supporto del disco di rottura in posizione e ruotarlo una volta verso destra con la chiave dinamometrica per serrarlo.
Quindi, immergere gli schermi a rete in etanolo al 100%. Una volta asciutto, posizionare uno schermo sulla piastra di montaggio in plastica bianca e posizionare il supporto del disco macrocarrier, con il lato del DNA rivolto verso il basso, nella camera del disco. Avvitare il tappo d'argento e posizionare la piastra di montaggio nella fessura più alta, quindi posizionare una piastra di agar YPD contenente 1 molare di sorbitolo sulla piastra inferiore.
Ora chiudi lo sportello della camera e bloccalo in posizione, quindi tieni premuto l'interruttore rosso centrale in posizione sollevata per attivare il vuoto e consentirgli di raggiungere 28 pollici di mercurio. Una volta raggiunto il livello di vuoto corretto e spostato l'interruttore centrale in posizione abbassata, tenere premuto l'interruttore rosso destro per accendere.
Quando il disco di rottura si apre, rilasciare immediatamente il pulsante di fuoco e spingere l'interruttore rosso centrale in posizione centrale per sfiatare la camera a 0 PSI. Se il tiro è andato a buon fine, un anello d'oro sarà visibile sulla targa. Pulisci il disco di rottura e i detriti del disco macrocarrier e spegni la pistola genetica, quindi ruota la manopola del serbatoio dell'elio in senso orario per spegnere il gas e spegnere la pompa del vuoto.